187709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes antigén preparátum és vakcina előállítására
1 .187 709. 2 A találmány tárgya eljárás malária ellen immunitást biztosító antigén anyagok, illetve ezeket tartalmazó vakcinák előállítására. A malária-paraziták a Plasmodium nemzetséghez tartozó protozoák. Ezek komplex élet-ciklusának egyik része a ciklikus aszexuális replikáció, mely egy gerinces parazitagazda erythrocytáin belül játszódik le, létrehozva a malária néven ismert betegség szimptómáit. A gerinces parazitagazda ezzel szemben védekező immun választ mutathat, mely a vérben született parazitákkal szemben hatékony. Ez azt jelenti, hogy a protozoa vérben élő alakjai antigéneket szintetizálnak, melyek hatására megindul a specifikus, védő antitestek képződése a fertőzött vagy immunizált gazdában. Az erythrocytákban végbemenő aszexuális replikációs ciklusban a szabad paraziták (merozoitok) felismerik, és specifikusan hozzátapadnak azerythrocyta felületéhez, majd a plazmamembrán betüremkedése útján behatolnak abba. A fertőzött erythrocytát trophozoitnak nevezik. A parazitáknak a sejten belüli differenciálódása alatt a sejtmag ismételten osztódik, és kialakul a schízonta. A sejtmag osztódását a cytoplazma szegmentációja követi és az erythrocytán belül számos egymagvú merozoit alakul ki. A schizonta membránok feloldódása után a merozoitok a plazmába jutnak és új erythrocytákhoz kapcsolódhatnak, illetve hatolhatnak be. Valószínű, hogy a maláriával szembeni immunitás azon antitestek közvetítésével alakul ki, melyek a schizontához és/vagy a parazita merozoit formájához kapcsolódó parazita antigénekre specifikusak. (Lásd pl.: Cohen, Proc. R. Soc. London B, 1978. 203, 323-345; Freeman és Parish, Exp. Párásítói. 1981. 52, 18-24.) Számos, a schizonta membránhoz kapcsolódó parazita antigént mutattak ki a szolubilizált schizonta anyag hiperimmun szérummal szemben végzett, keresztezett immunelektroforézisével (lásd pl. Deans’Dennis és Cohe, Parasitology, 1978. 77, 333-344; Schmidt-Ullrich, Wallach és Lightholder, J. Exp. Med. 1979. 150, 86-99). Az utóbbi csoport 3 antigént mutatott ki a Plasmodium knowlesi schizonta membránjából, melyek molekulasúlya 65 000, 90 000 és 125 000 volt. Ezeket az antigéneket a P. knowlesi és a P. falciparum immun széruma kicsapja. A P. knowlesival és a P. falciparummal kapcsolatban rendelkezésre álló adatok nem tesznek lehetővé pontos következtetéseket arra a fejlődési szakaszra (szakaszokra) vonatkozóan, ahol a parazita specifikus antigénjei immunogén hatásúak, vagy hogy a kimutatott antigének azok, melyek a védő immunitásért felelősek. (Schmidt-Ullrich és munkatársai: „The Host-Invader Interplay“, 1980. H. Van den Bossche szerkesztésében Elsevier/Nort Holland, Amsterdam, 117-120). A P. falciparum schizonta antigénjeit is leírták (Kilejian, Proc. Nat. Acad.Sci. 1980. 77, 3695-3699; J. Exp. Med. 1980. 151, 1534-1538; Perrin és munkatársai: Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1981. 75, 163-165). Ezek közül az antigének közül egyiket sem tisztították meg, illetve nem mutatták ki róluk, hogy védő antigének lennének. A schizonta membránokból származó, és 200 000-nél nem nagyobb molekulasúlyú antigénekre is van irodalmi utalás (Freeman és munkatársai: The Host-Invader Interplay, H. van den Bossche szerkesztésében Elsevier/North Holland Biochemical Press 1980. 121-124), de az egyetlen antitestről, melyet leírtak, egy ezekre az antigénekre specifikus monoklón antitestről kimutatták, hogy nem biztosít passzív immunitást. Meglepő módon azt találtuk, hogy egy, a schizonta membránból származó, és az előbb említett antitest által felismert antigén képes a maláriával szemben védelmet kifejleszteni, és egy ilyen, a Plasmodium paraziták schizonta formájához kapcsolódó antigént sikerült izolálnunk és azonosítanunk. Az így azonosított antigén egy Plasmodium nemzetségbeli parazitáknak védettséget előidéző, fehérjeszerü antigénje, melynek az alábbi jellemző tulajdonságai vannak. 1. Molekulasúlyúk 1,8 x 105 és 2,5 * 105 közé esik. 2. A parazita az erythrocyta schizonta és merozoit formájának membránjához kapcsolódik; és 3. Az erythrocytákon belül diszkrét töredékekké alakulnak, melyeknek ugyanolyan antigén tulajdonságai vannak, és amelyben az antigén, illetve annak diszkrét töredékei a parazita merozoit formájának felületi membránjához, illetve annak funkcionális származékaihoz kapcsolódnak. Ismeretes, hogy ezek az antigének számos patkányféle malária protozoájában előfordulnak, mint például a Plasmodium yoelli, Plasmodium oerghei és a Plasmodium vinckei fajokban, és a főemlősök malária parazitáiban, különösen a Plasmodium falciparumban. A „molekulasúly” azt a látszólagos molekulasúlyt jelenti, amit poliakrilamid gél elektroforézissal, a szokásos molekulasúlyjelzőkhöz viszonyítva, meghatároztunk. A találmány szerinti antigén fehérjék molekulasúlya kényelmesen meghatározható azzal a módszerrel, melyet U. K. Laemmli írt le (Nature, 1970. 227, 680-685). A jól használható, szabványos molekulasúly-jelzők közé tartozik például a spectrin heterodimer, melynek 2,2 x 105 és 2,4 x 105 a molekulasúlya. Az itt használt „kapcsolódnak” kifejezés nemcsak a malária parazitáinak a merozoit formájából illetve schizonta formájából származó fehérjeszerű antigén anyagokra utal, hanem bármely más forrásból származó, de azonos antigén tulajdonságú, hasonló vagy azonos aminosav szekvenciájú anyagokra. A találmány szerinti antigének a paraziták sejten belüli fejlődésének során csak az utolsó szakaszában képződnek. így a Plasmodium falciparum esetében ennek az antigén szintézisnek a kezdete egybeesik a schizogonia (a Plasmodium aszexuális ciklusa) megindulásával és a sejten belüli fázis végéig tart. Azt találtuk, hogy a képződött antigén jellemző tulajdonságai közé tartozik az, hogy az erythrocytán belül ugyanolyan antigén tulajdonságokkal rendelkező diszkrét, alacsonyabb molekulasúlyú töredékekké alakul, tekintet nélkül arra, hogy mely parazitából származik. Ezeknek a töredékeknek a 5 1 o 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
