187676. lajstromszámú szabadalom • Eljárás teljesen védett dezoxiribodinukleotidok előállítására
1 187 676 2 zö reagensek ezzel szemben vízmentes körülmények között évekig tárolhatók. 2. Az előállítás során nem lépnek fel olyan zavaró mellékreakciók, mint az 5'-helyzetű hidroxilcsoportok szulfonálása és a heterociklusos bázisok nem kívánt módosítása. 3. A szintézis körülményei olyanok, hogy a lehetséges két, szimmetrikus internukleotid kötést tartalmazó melléktermék közül az egyik egyáltalán nem, a másik pedig legföljebb elenyészően kis mennyiségben keletkezhet, amely viszont a főterméktől könnyen elválasztható. 4. A kiindulási anyagok közül az (V) általános képletű, kevésbé értékes nukleozidkomponens van feleslegben, és ennek feleslege a feldolgozás során visszanyerhető és újra felhasználható. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A példákban az A, C, G és T rövidítések rendre a 3'-0-foszforiloxi-2'-dezoxi-adenozil-, 3'-0- foszforiloxi-2'-dezoxi-citidil-, 3'-0-foszforiloxi-2'dezoxi-guanozil- és 3'-0-foszforiloxi-timidilcsoportoknak megfelelő szerkezeti egységeket jelentik. A vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat adatainál az Rr-értéket az adott dimer 5'-terminális egységét képező 5'-0-(adott esetben szubsztituált trifenilmetil)-N-acil-2'-dezoxi-ribonukleozidra vonatkoztatjuk. A eluálószerek összetételét térfogatiban adjuk meg. 1. példa Teljesen védett, C-C szekvenciát tartalmazó dezoxiribodinukleotid előállítása 0,86 g (1,5 mmól) N4-benzoil-dezoxicitidin-3'(/4-klór-fenil/-/2-ciano-etil/-foszfát)-hoz szobahőmérsékleten 6,6 ml vízmentes dioxánban oldott (4- klór-fenil)-foszfoditriazolidot (0,25 mólos oldat; 1,65 mmól) adunk. Az így kapott oldatot szobahőmérsékleten 20 percig állni hagyjuk, majd hozzáadjuk 1,71 g (2,7 mmól) 5'-0-(4,4'-dimetoxi-trifenílmetil)-N4-benzoil-dezoxicitidin 2,7 ml vízmentes dioxánnal készített oldatához. Ezután az oldathoz 0,66 ml (8,25 mmól) N-metil-imidazolt adunk, majd a reakcióelegyet csökkentett nyomáson, szobahőmérsékleten eredeti térfogatának körülbelül 50%-ára bepároljuk. Az így kapott reakcióelegyet szobahőmérsékleten 3 órán át állni hagyjuk, majd csökkentett nyomáson bepároljuk. A kapott olajszerű anyagot 60 ml kloroformban oldjuk, és ötször 25 ml 0,1 mólos vízmentes nátrium-dihidrogén-foszfát-oldattal extraháljuk. A szerves fázist szárítás után bepároljuk, és a maradékot 8 ml acetonban oldjuk. Az oldatot 45% víz - 55% aceton elegyben feltöltött, szilanizált szilikagél oszlopra (2,5 cm x 25 cm) öntjük fel, majd ott 8 ml víz hozzáadásával kicsapjuk, az anyagot. A sűrű, csapadékos elegyet az oszlopba engedjük, az oszlopot először 600 ml 45% víz - 55% aceton eleggyel, majd 800 ml 40% víz - 60% aceton eleggyel mossuk. Az utóbbi eleggyel lemosott, és a kívánt dinukleotidszármazékot tartalmazó frakciókat egyesítjük, s az acetont csökkentett nyomáson lepároljuk. A kapott, körülbelül 300 ml térfogatú szuszpenziót kétszer 100 ml etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfáttal, majd Whatman PS1 papíron szűrve szárítjuk, és 30 °C-on, csökkentett nyomáson bepároljuk. 1,47 g színtelen, habszerű anyagot kapunk. Kitermelés: 71,4%. A vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat adatai: a) Szilanizált szilikagél réteg, 30 : 70 arányú víz : aceton elegy : Rr = 0,73 (a kiindulási 5'-terminális nukleozid-komponensre vonatkoztatva). b) Szilikagél 60 F254 réteg, 10 : 90 arányú metanol : kloroform elegy: a fenti kiindulási anyaggal átfedésben lévő elnyúló folt (detektálás UV-fényben, illetve sósavgázzal). Spektroszkópiai tisztaságú 96%-os etanolban mért spektrális jellemzők: K-M. = 270 nm; E|| = 0,87; E || = 0,46. A 45% víz - 55% aceton eleggyel kapott frakciókból hasonló módon végzett feldolgozással az 5'- 0-(4,4'-dimetoxi-trifenilmetil)-N4-benzoil-dezoxicitidin kiindulási mennyiségének körülbelül 40%-a tisztán visszanyerhető. 2. példa Teljesen védett, G-T, T-T és C-T szekvenciákat tartalmazó dezoxiribodinukleotidok előállítása 2,2 g (4,5 mmól) timidin-3'-(/4-klór-fenil/-/2- ciano-etil/-foszfát)-ot oldunk 19,8 ml vízmentes dioxánnal készített 0,25 mólos (4-klór-fenil)-foszfoditriazolid oldatban (az oldat összesen 4,95 mmól foszfoditriazolid reagenst tartalmaz). Az oldatot 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd három egyenlő részre osztjuk. Egy-egy harmadot adunk 1,44 g (2,25 mmól) 5'-0-(4,4'-dimetoxi-trifenilmetil)-N2-izobutiril-dezoxiguanozin 8,4 ml vízmentes dioxánnal készített oldatához, 1,47 g (2,7 mmól) 5'-0-(4,4'-dimetoxi-trifenilmetil)-timidin 5,4 ml vízmentes dioxánnal készített oldatához, illetve 1,71 g (2,7 mmól) 5'-0-(4,4'-dimetoxi-trifenilmetil)N4-benzoil-dezoxicitidin 2,7 ml vízmentes dioxánnal készített oldatához, majd mindhárom elegyhez 0,66 ml (8,25 mmól) N-metil-imidazolt adunk. Ezután az első két reakcióelegyet eredeti térfogatának körülbelül 40%-ára, a harmadikat pedig eredeti térfogatának körülbelül 50%-ára bepároljuk. Az elegyeket szobahőmérsékleten 3 órán át állni hagyjuk, majd az 1. példában ismertetett módon nyerstermékké feldolgozzuk. A nyers termékek oszlopkromatográfiás tisztítását is az 1. példában leírtakhoz hasonlóan végezzük. A 8 ml acetonban oldott anyagot a szilanizált szilikagéllel töltött, 2,5 x 25 cm méretű oszlop tetején 8 ml vízzel kicsapjuk. A feleslegben alkalmazott 5'-0-(4,4'-dimetoxi-trifenilmetil)-N2-izobutiril-dezoxiguanozint, illetve 5'- 0-(4,4'-dimetoxi-trifenilmetil)-timidint 400 ml 45% víz - 55% aceton eleggyel, az 5'-0-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-N4-benzoil-dezoxicitidin feleslegét 600 ml 45% víz - 55% aceton eleggyel mossuk le. A teljesen védett, G-T és T-T szekvenciákat tartalmazó dinukleotidokat 400 ml 40% víz - 60% aceton eleggyel, míg a C-T szekvenciát tartalmazó dinukleotidot 600 ml 40% víz - 60% aceton eleggyel 5 1f 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
