187676. lajstromszámú szabadalom • Eljárás teljesen védett dezoxiribodinukleotidok előállítására
1 187 676 2 ter komponensre vonatkoztatott kitermelés mindössze 52-59%, és a reakcióelegy feldolgozása során a tiszta céltermék ennél jóval kisebb mennyiségben különíthető el. A találmány célja olyan eljárás kidolgozása teljesen védett dezoxiribodinukleotidok előállítására, amely bifunkciós foszforilezőszer felhasználásával kiküszöböli, illetve minimálisra csökkenti a szimmetrikus intemukleotid kötést tartalmazó melléktermékek képződését, és lehetővé teszi a feleslegben alkalmazott reagensek visszanyerését. A találmány alapja az a felismerés, hogy amenynyiben a (II) általános képletű, az 5'-helyzetben szabad hidroxilcsoportot tartalmazó 3'-foszfotriészter-vegyületeket (III) általános képletű foszforilezőszerekkel reagáltatjuk, a kiindulási anyagok 5'-helyzetű hidroxilcsoportja már kis fölöslegben alkalmazott foszforilezőszer hatására is rendkívül gyorsan és kvantitatíve foszforileződik. A (II) és (III) általános képletű vegyületek reakciójának sebessége nagyságrendekkel meghaladja a konkurens reakció (/II/ általános képletű vegyületek egymás közötti reakciója) sebességét, így az 5'-5' internukleotid kötés képződése teljes biztonsággal kiküszöbölhető. Tekintettel arra, hogy a (III) általános képletű foszforilezőszert igen kis fölöslegben alkalmazzuk, a fölösleg utólagos elbontására nincs szükség. A találmány továbbá azon a felismerésen alapul, hogy a foszforilezési reakcióban kapott (IV) általános képletű, a 3' és 5' helyzetben egyaránt foszforilcsoportot tartalmazó vegyületet (V) általános képletű, a 3'-helyzetben szabad hidroxilcsoportot tartalmazó nukleotidokkal reagáltatva a reakció elsősorban a (IV) általános képletű vegyületek 5'-helyzetű foszforilcsoportja és az (V) általános képletű vegyületek szabad hidroxilcsoportja között megy végbe, és csak elenyészően kis (legföljebb 1%-os) mennyiségben képződnek 3'-3' internukleotid kötést tartalmazó melléktermékek. Ezek a melléktermékek oszlopkromatográfiás úton könnyen eltávolíthatók, és ugyanakkor az (V) általános képletű vegyületek fölöslege is visszanyerhető. A találmány szerint tehát az (I) általános képletű vegyületeket igen tiszta állapotban, a szakirodalomban közölteknél nagyobb hozammal különíthetjük el, és ugyanakkor a reagens fölöslegét is további felhasználásra alkalmas formában visszanyerhetjük. A találmány szerint az (I) általános képletű, teljesen védett dezoxiribonukleotidokat - a képletben R jelentése szubsztituálatlan vagy metoxicsoporttal szubsztituált trifenilmetil-csoport, előnyösen 4,4'dimetoxi-trifenilmetil-csoport, Ar halogénezett fenilcsoportot, előnyösen 2- klór- vagy 4-klór-fenil-csoportot jelent, és B1 és B2 egymástól függetlenül (a), (b), (c) vagy (d) általános képletű csoportot jelent, amelyekben W jelentése szubsztituálatlan vagy egy vagy két 1-4 szénatomos alkilcsoporttal 1-4 szénatomos alkoxicsoporttal, halogénatommal és/vagy nitrocsoporttal szubsztituált benzoilcsoport (előnyösen szubsztituálatlan benzoilcsoport), Q 2-4 szénatomos alkanoilcsoportot, előnyösen izobutiril-csoportot jelent, és X adott esetben halogénatommal szubsztituált 1-4 szénatomos alkilcsoportot vagy adott esetben halogénatommal szubsztituált 2-5 szénatomos alkenilcsoportot, előnyösen metilcsoportot jelent - úgy állítjuk elő, hogy a) 1 mólekvivalens (II) általános képletű dezoxiribonukleozid-3'-foszfát-triésztert vízmentes szerves oldószerben 1,0-1,1 mólekvivalens (III) általános képletű foszfoditriazoliddal reagáltatunk - a képletekben Ar és B1 jelentése a fenti -, és a kapott (IV) általános képletű vegyületet - a képletben Ar és B1 jelentése a fenti - célszerűen magában a képződési reakcióelegyben, nukleofil katalizátor, előnyösen N-metil-imidazol jelenlétében 1,2-2,0 mólekvivalens (V) általános képletű 5'-0-védett dezoxiribonukleoziddal - a képletben R és B2 jelentése a fenti - reagáltatjuk, majd a kapott (I) általános képletű vegyületet önmagukban ismert bepárlási és kromatográfiás műveletekkel elkülönítjük; vagy b) 1 mólekvivalens (IV) általános képletű vegyületet - a képletben Ar és B1 jelentése a fenti - nukleofil katalizátor, előnyösen N-metil-imidazol jelenlétében 1,2-2,0 mólekvivalens (V) általános képletű 5'-0-védett dezoxiribonukleoziddal - a képletben R és B2 jelentése a fenti - reagáltatunk, majd a kapott (I) általános képletű vegyületet önmagukban ismert bepárlási és kromatográfiás műveletekkel elkülönítjük. Az (I) általános képletű vegyületeket előnyösen a következőképpen különítjük el a reakcióelegyből: A reakcióelegyet csökkentett nyomáson eredeti térfogatának körülbelül felére bepároljuk, és 1-5 órán át (előnyösen 3 órán át) állni hagyjuk. Ezután a koncentrátumból csökkentett nyomáson lepároljuk az oldószert, a maradékot kloroformban oldjuk, a kloroformos fázist vizes nátrium-dihidrogénfoszfát oldattal mossuk, szárítjuk, majd a kloroformot lepároljuk. A maradékot acetonban oldjuk, és az acetonos oldatot víz-aceton elegyben feltöltött, szilanizált szilikagélt tartalmazó kromatográfiás oszlopra visszük fel. Az acetonnal azonos térfogatú víz hozzáadásával kicsapjuk az oszlop tetején az anyagot, majd a csapadékos elegyet az oszlopba engedjük, és a termékelegy komponenseit két lépcsőben végzett, víz-aceton elegyekkel történő lemosással elválasztjuk egymástól. Az egyes frakciókat normál vagy fordított fázisú vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat öszszegyűjtjük, és az acetont csökkentett nyomáson lepároljuk. A kapott szuszpenziót etil-acetáttal vagy kloroformmal extraháljuk, a szerves fázist szárítjuk, majd bepároljuk. így az (I) általános képletű vegyületeket rendkívül tiszta állapotban, 68-75%-os hozammal kapjuk az értékes (II) általános képletű kiindulási anyagokra vonatkoztatva. A találmány szerinti eljárással kapott (I) általános képletű vegyületek szilárd, színtelen anyagok, kromatográfiásan egységesek, és -20 C°-on legalább 8-12 hónapon át tárolhatók bomlás nélkül. A korábbi módszerekkel összehasonlítva a találmány szerinti eljárás előnyei a következőkben foglalhatók össze: 1. Nincs szükség az általánosan alkalmazott arilszulfonsav-azolid-típusú kapcsolószerekre. Ezek egyébként nem stabil vegyületek, és folyamatos felhasználásuk esetén gyakori (néhány hetenkénti) előállításuk szükséges. A találmány szerinti eljárás során felhasznált (III) általános képletű foszforile-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
