187676. lajstromszámú szabadalom • Eljárás teljesen védett dezoxiribodinukleotidok előállítására
2 187 676 A találmány tárgya új eljárás az (I) általános képletű, teljesen védett dezoxiribodinukleotidok előállítására. Az (I) általános képlettel jellemzett, védett dezoxiribodinukleotidok a kémiai DNS szintézis nagyon fontos kiindulási anyagai. Az ún. foszfotriészter módszer folyadék- és szilárdfázisú változata is legcélszerűbben a dimer építőköveket alkalmazza, mivel meglehetősen kis számuk (16, ellentétben a 64 lehetséges trimerrel szemben) is lehetővé teszi bármilyen nukleotid-sorrendű DNS szakasz előállítását. A folyadékfázisban végzett szintézisek során a teljesen védett (I) általános képletü származékok kétféleképpen tehetők funkcióképessé, mivel akár az 5'-helyzetű hidroxilcsoportot védő 4,4'-dimetoxi-trifenilmetil-csoport, akár a 3'-helyzetű foszfátcsoportot védő 2-ciano-etil-csoport egymástól függetlenül eltávolítható, s így a felépítendő DNS szakasz szintézise mindkét irányban lehetségessé válik. 2Q A dimer építőköveket alkalmazó szilárdfázisú módszer a 2-ciano-etil védőcsoport eltávolítása után kapott, 3'-foszfodiészter-csoportot tartalmazó védett származékot használja kiindulási anyagként. Ez utóbbi technika vezetett el, többek között, 2g az eddigi legnagyobb szintetikus gén, az emberi leukocita interferont kódoló gén kémiai szintéziséhez (Edge és munkatársai: Nature 292, 756 /1981/). A teljesen védett dezoxiribodinukleotidok szintézisére több módszer ismeretes, amelyek két fő cső- 3Q portba sorolhatók. Az első csoportba tartozó módszerek szerint az internukleotid-triészter kötést az 5'-hidroxil csoporton védett 3'-foszfodiészter komponensek öszszekapcsolásával építik ki, és kapcsolószerként aro- 35 más szulfonsavazolid típusú vegyületeket használnak, A második csoportba tartozó módszerek szerint bifunkciós foszforilezőszereket alkalmaznak az intemukleotid kötés kiépítésére egy kétlépéses reak- 4Q dóban. Az első lépésben az 5'-hidroxilcsoporton védett dezoxiribonukleozid szabad 3'-hidroxilcsoportját bifunkdós foszforilezőszerrel foszforilezik, majd az így kapott monofunkdós intermediert a szabad 5'-hidroxilcsoportot tartalmazó 3'-foszfotriészter komponenssel reagáltatják katalizátor je- 5 lenlétében. Az első csoportba tartozó módszereknek több hátránya van. Habár a kapcsolási reakdó jó termeléssel szolgáltatja a védett dinukleotid-származékot, néhány mellékreakdó fellépésével kell számol- 50 ni. így a kapcsoló reagens a szabad 5'-hidroxilcsoportot szulfonálja (Nucleic Adds Res. 7, 1955 /1979/ és 8, 2301 /1980/; Tetrahedron Letters 21, 2841 /1980/), ezenkívül a heterociklusos bázisokat módosíthatja (Nucleic Acids Res. 7, 1955 /1979/; 55 Tetrahedron Letters 21, 2265 /1980/ és 22, 4755 /1981 /). Mindkét típusú reakdó olyan melléktermékeket eredményez, amelyek a kívánt terméktől nehezen, vagy egyáltalán nem választhatók el a szokásos oszlopkromatográfiás módszerekkel. 60 A különféle szennyezéseket tartalmazó dimerek további összekapcsolása azután egyre bonyolultabb termékelegyet szolgáltat. További hátrányt jelent, hogy a kapcsolási reakcióhoz az értékes aktivált foszfodiészter komponenst viszonylag nagy (1 mól 65 szabad 5'-hidroxilcsoportot tartalmazó nukleozidra vonatkoztatva rendszerint 1,5-2 mól) mennyiségben használják fel. Az aktivált foszfodiészter komponens fölöslege a reakció lezajlása után nem nyerhető vissza, az elegy feldolgozása során teljes egészében elvész, ami tetemesen növeli a szintézis költségeit. Példaként említjük, hogy a Tetrahedron Letters 21,2841 (1980) közlemény 5'-0-(4,4'-dimetoxi-trifenilmetil)-timidin-3'-(4-klór-fenil)-foszfát és 3'-0- acetil-timidin összekapcsolását ismerteti, amelynek során a szerzők a kívánt, teljesen védett dinukleozidot 97-98%-os hozammal kapják. Ez az érték azonban a 3'-0-acetil-timidinre vonatkoztatott, nagynyomású folyadékkromatográfiás elemzéssel meghatározott adat. Az értékes 5'-0-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-timidin-3'-(4-klór-fenil)-foszfátra vonatkoztatott kitermelés csupán 65% körüli érték. A reakcióelegyben lévő szennyezőanyagok eltávolítása rendkívül nehézkes, így az elegy feldolgozása után a tiszta, további reakciókra alkalmas védett dezoxiribodinukleotid hozama az értékes foszfodiészter komponensre vonatkoztatva már csak 50% körüli érték. A módszerek további hátránya, hogy a legaktívabb kapcsolószerek meglehetősen labilis vegyületek, ezért gyakori szintézisük szükséges. A második csoportba tartozó, külön kapcsolószer nélkül, bifunkciós foszforilezőszerekkel végzett eljárások során szintén felléphetnek mellékreakciók, amelyek szimmetrikus, 3'-3' és 5'-5' internukleotid kötések kiépüléséhez vezetnek. Ahhoz, hogy a 3'-3' internukleotid kötést tartalmazó dinukleotid származék ne képződhessen, a 3'-hidroxilcsoport kvantitatív foszforilezése szükséges az első lépésben, amely csak a foszforilezőszer feleslegének (általában másfél mólekvivalensnyi felesleg) alkalmazásával valósítható meg. A második lépésben az elreagálatlan foszforilezőszer a keletkezett monofunkciós intermedierrel verseng a 3'-foszfotriészter komponens szabad 5'-hidroxilcsoportjának foszforilezéséért, s így 5'-5' internukleotid kötés képződésére nyílik lehetőség. Ennek elkerülése céljából a Nucleic Acids Res. 8, 5461 (1980) közlemény szerint a bifunkciós reagens feleslegét vizes piridinnel hidrolizálják, kontrollált körülmények között. Az aktivált nukleotid-származékot - amely jóval lassabban hidrolizál - azután körülbelül másfél mólekvivalens feleslegben reagáltatják az 5'helyzetben szabad hidroxilcsoportot tartalmazó reagenssel. Az eljárások hátránya tehát az, hogy a célterméktől nehezen eltávolítható, szennyező melléktermékek ebben az esetben is képződnek, és az értékes 3'-foszfotriészter komponens feleslege nem nyerhető vissza, az a reakcióelegy feldolgozása során teljes egészében elvész. így például a Nucleic Acids Res. 9, 2003 (1981) közlemény szerint - amely adenozin-dimerek előállítását ismerteti - a céltermék legföljebb 60%-os hozammal állítható elő. A Nucleic Acids Res. 8, 5461 (1980) közlemény 75-85%-os kitermelést ad meg, ez az érték azonban a szabad 5'-helyzetű hidroxilcsoportot tartalmazó reagensre vonatkoztatott, nagynyomású folyadékkromatográfiás elemzéssel meghatározott adat. Az értékes foszfotriész-2
