187416. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kimotripszin vagy tripszin aktivitásának székletben történő meghatározására
1 2 187416 készített addíciós termékek, a polialkoholok aminoxidjai és zsírsavak észterei, valamint a faggyúalkohol-poliglikoléter. A kationos tenzidek például egyenes szénláncú vagy gyűrűs ammóniumvegyületek, mint például az N-cetil-N-etil-morfolin-metil- 5 szulfonát, továbbá benzalkónium-kloridok és egyéb kvatemer ammóniumsók, aminsók, piridiniumsók vagy kvatemer zsíramin-poliglikol-éterek lehetnek. A leginkább megfelelő tenzid kiválasztása a re- 10 akció körülményeitől is függ, így különösen függ az enzim és a szubsztrátum fajtájától, az alkalmazott sóktól és azok koncentrációjától,’valamint a közeg pH-jától. A találmány szerinti eljáráshoz leginkább alkal- 15 más kationos detergensek közül a legerősebb aktivitással a kvatemer ammóniumvegyül^tek és ezek 20 25 35 40 közül- is az R,R2N(CH3)2 általános képletnek megfelelő vegyületek rendelkeznek - ebben a képletben Rj előnyösen 8-14 szénatomos alkilcsopórtot, különösen lauril- vagy cetilcsoportot jelent, R2 jelentése előnyösen valamely 1-5 szénatomos rövidszénláncú alkilcsoport, aralkilcsoport vagy hidroxi-alkil-csoport, de különösen metilcsoport vagy benzilcsoport. Ilyenek továbbá még az alkil-piridinium-sók, melyek alkilcsoportja előnyösen 12-18 szénatomot tartalmaz, mint például a lauril-piridinium-klorid, a lauril-piridinium-diszulfát és kiváltképpen a hexadecil-piridinium-klorid. A találmány 30 szerinti eljáráshoz különösen alkalmas tenzid a lauril-trimetil-ammónium-klorid. A széklet szuszpendálására használt homogenizáló oldatban a felületaktív anyag koncentrációja általában körülbelül 0,02 - körülbelül 10 súly%, előnyösen 0,5-5 súly%. A mérésre kerülő oldatban (a székletszuszpenzió és a szubsztrátumoldat) a felületaktív anyag koncentrációja célszerűen körülbelül 0,005-0,5, előnyösen 0,01-0,3 súly%. A székletminta koncentrációja a szuszpenzióban 0,2-2% között lehet, amennyiben szubsztrátumként például Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA-t alkalmazunk. A széklet szuszpendálására használt homogenizáló oldat a felületaktív anyag mellett előnyösen még egy vagy több vízoldható sót is tartalmazhat, 45 ilyenek például az alkálifém- és/vagy az alkáliföldfém-kloridok vagy -szulfátok. Különösen célszerű, ha az oldat 100-1000 mmól/1.. nátrium-kloridot vagy 20-500 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmaz, illetve ha a megadott koncentráció-tartományon belül mindkét sót tartalmazza. Alkalmasak még a szerves sók is, mint például az acetátok vagy a citrátok, továbbá más kationokkal alkotott sók is alkalmazhatók. Az említett sókat célszerűen olyan koncentrációban használjuk, ami 20-1000 mval/1 ionerősségnek felel meg. Meglepő módon azt állapítottuk meg, hogy a felületaktív anyagot és sókat (ionerősség) tartalmazó homogenizáló oldatok alkalmazása esetén az enzimaktivitás növekedése az additív növekedést meghaladja (a reakciósebesség nagyobb lesz). Ez azt jelenti, hogy a növekedés nagyobb, mint amennyi a felületaktív anyag jelenlétében, illetve a sók jelenlétében kapott értékek összege. Részletesebben kifejtve: csakis a sóból és detergensből álló gg 50 55 60 kombináció képes - az egyes komponensekkel ellentétben - oldatba vinni a részecskékhez kötött enzim reprezentatív részét és így állandó, magas koncentrációt tud biztosítani. Szubsztrátumként általában véve a technika állásából ismert, bármelyik szubsztrátum használható, amelyik kimotripszin vagy tripszin aktivitásának székletből történő meghatározására az eddigi módszerek szerint alkalmas [lásd például: Grossman, Proc. Soc. Bioi. Med. 110 (1962), 41; Del Mar és szerzőtársai, Anal. Biochem. 99 (1979) 316; Nakajama és szerzőtársai, J. Bioi. Chem. 254 (10) (1979), 4027-4032]. A kimotripszin meghatározásához - főleg, vízoldhatósága, stabilitása, Km-értéke és sebességi állandója alapján - különösen alkalmasnak bizonyult az Ala-Ala-Phe-pNA, de mindenekelőtt a Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA és a MeO-Succ- Arg-Pro-Tyr-pNA. Azemlített szubsztrátumok nagyon jól használhatók a fotometriás meghatározáshoz. A tripszinaktivitás meghatározásához igen alkalmas szubsztrátum például a Chromozym TRY®, ami karbobenzoxi-valil-glicil-arginin-pnitro-anilid-acetát. A reagensoldat előállítása céljából a szubsztrátumot vízben, vagy víz és valamilyen szerves oldószer elegyében oldjuk. A szerves oldószer emellett még oldásközvetítőként is szolgál a szubsztrátum számára. Az oldószer példának okáért acetonitril, dimetil-szulfoxid, aceton vagy metanol lehet. A reagensoldat előnyösen még ugyanazokat a sókat is tartalmazza, mint amilyeneket a homogenizáló oldatnál használunk, de ezen sók koncentrációja a reagensoldatban általában alacsonyabb annál, mint amilyen koncentrációban a sókat a homogenizáló oldat készítésénél alkalmazzuk. Az együttes sókoncentráció előnyös módon körülbelül 10-500 mmól/1, így például 250 mmól/1 nátrium-klorid és 20 mmól/1 kalcium-klorid lehet. A mérést úgy hajtjuk végre, hogy a székletmintának a homogenizáló oldattal készült szuszpenziójából, vagy pedig a centrifugálás útján kapott felületúszóból (a centrifugálást a felülúszó teljes feltisztulásáig végezzük) egy bizonyos mennyiséget a reagensoldathoz adunk (így például 100 pl székletminta-szuszpenziót adunk 2 ml reagensoldathoz), majd a hasadási sebességet például titrálással vagy fotometriás úton meghatározzuk. A vizsgálandó minta mennyiségét - vagyis a minta hígítási arányát - úgy választjuk meg, hogy jól mérhető értékeket kapjunk, így például a várható enzimaktivitásnak megfelelően az extinkciónövekedés/perc a jól mérhető értékek tartományába essen. Detergens alkalmazásával az érzékenység megnő, ami lehetővé teszi, hogy a vizsgálandó anyag mennyiségét olyan alacsonyan válasszuk meg, melynél a szuszpendált szilárd részecskék saját abszorbciója csekély és ez lehetővé teszi a szuszpenzió fotometriás úton történő mérését. A homogenizáló oldat pH-ja különösebben nem kritikus és az általában 3—10 lehet, de a 6-8 közötti pH-értékek előnyösek. A próba szuszpenziójából és a reagensoldatból álló elegy pH-ertéke általában 8-10 közötti lehet, a pH = 9 érték előnyös. Ezeket a pH-értékeket célszerűen a reagensoldat pH-jával állítjuk be. Előnyös lehet, ha a pH-érték beállítása céljából az oldatokhoz alkal-
