187416. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kimotripszin vagy tripszin aktivitásának székletben történő meghatározására

1

187 416

2

mas puflerelegyeket adunk, ilyenek például a triszpufler, a glicin-puffer vagy a glicil-glicin-puffer. A pufferkoncentráció általában 10-100 mmól/1, különösen 50-200 mmól/1.

Amennyiben a kimotripszin mennyisége igen csekély - ami például akkor lép fel, ha az alkalmazott adagolóberendezés csak a határfelületen levő .kimotripszin meghatározását teszj lehetővé -, úgy célszerűen egy különlegesen érzékeny kimutatási reakciót alkalmazunk. Ilyen érzékeny reakciót ismertetnek a J. Bioi. Chem. 128 (1939) 537. irodalmi helyen, ami Bratton/Marshall-reakció néven közismert. Ez nátrium-nitrit és N-a-naftil-etilén-diamin, majd ezt követően valamilyen sav hozzátételén alapszik, mimellett savként előnyösen triklór-ecetsavat vagy valamilyen ehhez hasonló erősségű savat használunk.

Magát a mérést lehet manuálisan is elvégezni, vagy pedig valamilyen automatizált analizálóberendezést alkalmazunk. Az aktivitás fotometriás úton történő meghatározásánál, de különösen az automatizált fotometriás mérésnél (extinkciómeghatározás) célszerű, ha a vizsgálandó minta szuszpenzióját a mérés előtt annak feltisztulásáig fugáljuk.

A találmány szerinti eljárás véghezviteléhez különösen célszerűnek bizonyult egy olyan berendezés alkalmazása, amely a bejelentő P 31 39 702.6 számú német szövetségi köztársaság-beli találmányi bejelentésben került ismertetésre. A bejelentés címe: „Edény pasztaszerű vizsgálati anyagok kezelésére”. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy a mintavételt, az adagolást, a feldolgozást és a mérést egyszerű módon és esztétikusán végezzük és ezáltal sem a beteget, sem a laboratóriumi személyzetet különösebben nem terheljük.

A következő Példák a találmány közelebbi megmagyarázására szolgálnak anélkül azonban, hogy a találmány csupán ezekre a Példákra korlátozódna. Amennyiben más megjelölés nincs, úgy a százalékban megadott adatok súly%-ot jelentenek.

1. Példa

a) Homogenizáló oldat előállítása:

Nátrium-klorid 2,9 g ( = 500 mmól/1)

Kalcium-klorid 1,1 g (= 100 mmól/1)

33%-os lauril-trimetil-2,0 g (=0,7%) ammónium-klorid Desztillált víz ad 100 ml.

b) Reagensoldat előállítása:

Succ-Ala-Ala-Pro-Phe- 29,5 mg (0,5 mmól/1) pNA

Nátrium-klorid 1,46 g (250 mmól/1)

Kalcium-klorid 222 mg (20 mmól/1)

T risz-puffer/HCL, pH=9,0

60 mmól/1 ad 100 ml.

c) A vizsgálandó minta homogenizálása: Körülbelül 100 mg székletmintához százszoros súlymennyiségű homogenizáló oldatot adunk és valamilyen erre alkalmas berendezésben finom eloszlású szuszpenziót készítünk.

d) A mérés kivitelezése:

1 cm-es mérőküvettába 2 ml reagenst pipettázunk, a hőmérsékletet 25 *C-ra beállítjuk és ezen az értéken tartjuk, majd a székletminta-homogenizátumból hozzáadunk lOOpl-t. Gyors összekeverés után 405 nm hullámhosszon meghatározzuk az extinkciónövekedés/perc értékét. Az enzimaktivitás/g széklet kiszámítására a 405 nm-en mért extinkciónövekedés/perc értéket egy faktorral kell beszorozni, ez a faktor: 212.

2. Példa

A homogenizáló oldatot és a reagensoldatot az

1. Példa szerint állítjuk elő és a minta homogenizálását is az 1. Példában leírtak szerint végezzük. A homogenizálás után a szuszpenziót a teljes feltisztülásig centrifugáljuk. A centrifugálással kapott felülúszóból alikvot részt veszünk ld és annak enzimaktivitását - akár az 1. Példában ismertetett manuális módszerrel, akár egy automatikus analizáló berendezéssel - meghatározzuk.

3. Példa

á) Homogenizáló oldat előállítása:

Vizes oldatot készítünk az alábbiakban felsorolt anyagokból:

Trisz/HCL-puffer, pH=9,0 60 mmól/1

Nátrium-klorid 250 mmól/1

Kalcium-klorid 20 mmól/1

Lauril-trimetil-ammónium-klorid 0,7%

b) Reagensoldat előállítása:

A reagensoldatot az 1. Példa szerint készítjük.

c) A vizsgálandó minta homogenizálása:

A minta homogenizálását az 1. Példában leírt módon végezzük.

d) A mérés kivitelezése:

A mérést az 1. Példában leírt módon valósítjuk meg.

4. Példa

(összehasonlításra szolgáló példa)

A 4. Példa mindenben a 3. Példával azonos, az egyetlen eltérés, hogy a homogenizáló oldat nem tartalmaz detergenst (lauril-trimetil-ammóniumklorid).

A 3, Példa szerinti reagenssel és a 4. Példa szerinti reagenssel összehasonlító méréseket, végzünk, melynek során azonos vizsgálati anyag aktivitását méljük. Ezen összehasonlító mérések egymással szembeállítva az alábbi eredményeket adják:

5

10.

15

20

25

30

35

40

S

45

50

55

60

65

4