187416. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kimotripszin vagy tripszin aktivitásának székletben történő meghatározására
1 187416 2 Krónikus pankreatitisz (idült hasnyálmirigygyulladás) vagy mukoviszcidózis gyanúja esetén a pankreászelégtelenség (pankreászinszufficiencia) diagnózisának megállapítása emlősöknél egy nagyon fontos paraméter, melynek klinikai és kémiái kimutatását mind a mai napig nem sikerült megnyugtató módon megoldani. A leginkább megbízható módszernek általában a pankreozimin-szekretin-tesztet tekintik a szakemberek. Ennek során pankreoziminnel és szekretinnel végzett stimulálás után egy szonda segítségével a pankreásznedvet elvezetik és ezt követően az alábbi paramétereket vizsgálják: térfogat, hidrogén-karbonát-koncentráció, amiláz-, lipáz-, tripszin- és kimotripszin-aktivitás. A módszer legnagyobb hátránya, hogy megvalósításához hosszú időre és nagy technikai felszerelésre van szükség, továbbá a vizsgálat a beteget is nagyon terheli. Egy további módszer, melyet krónikus hasnyálmirigy-gyulladás, illetve a mukoviszcidózis kimutatására és ezen betegségek lefolyásának ellenőrzésére használnak, a kimotripszin vagy a tripszin meghatározása a beteg székletében. Krónikus hasnyálmirigy-gyulladás vagy mukoviszcidózis esetén a tripszin- és a kimotripszin-aktivitás mértéke lecsökken, mimellett a kimotripszinre vonatkozó értékek jelentik a kifejezőbb paramétert. A székletben levő kimotripszirit vagy tripszint úgy határozzák meg, hogy a széklet vizes-metanolos oldattal készített szuszpenziójához egy specifikus szubsztrátumot adnak és az időegységenként felszabaduló aminosavat mérik. A felszabadult aminosavat például valamilyen alkalikus mérőoldattal, így különösen nátrium-hidroxid-oldattai végzett titrálással lehet meghatározni [pH-stat-eljárás, lásd: Haverback és szerzőtársai: Gastroenterology 44 (1963) 588-597; Ammann: Fortschritte in der Pankreasfunktionsdiagnostik, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York (1967)], vagy pedig azt az időt mérik, ami az oldat pH-jának 0,1 egységnyi csökkenéséhez szükséges [pH-drop-eljárás, lásd: Robinson, Smith, Elli-, ot: Clin. Chim. Acta 62 (1975) 225-229.]. A székletben levő kimotripszin vagy tripszin aktivitásának meghatározására szolgáló eddig ismert módszerek, hátrányos tulajdonsága, hogy jelentős felszerelést igényelnek és a véghezvitelükhöz sok idő szükséges. Az aktivitás gyors és egyszerű meghatározása fotometriás úton eddig nem volt lehetséges. A meghatározandó paraméterekhez képest kismennyiségű mintából kiindulva a meghatározás nem lesz kielégítően pontos, míg nagyobb mennyiségű próbaanyag esetén a szuszpendált részecskék által okozott elszíneződés és zavarosodás túl erős lesz. A székletszuszpenzió centrifugálás utáni fotometriás vizsgálata azért nem alkalmas a meghatározásra, mert az enzim viszonylag erősen kötődik a székletrészecskékhez és a centrifugálás után csaknem teljes egészében a szedimentumban van, vagy pedig csak részlegesen és nem reprodukálható mértékben megy át az oldatba. A jelen találmány célkitűzése ennélfogva egy olyan eljárás kidolgozása volt, amely alkalmas a székletben levő kimotripszin vagy tripszin aktivitásának gyors, egyszerű, pontos és jól reprodukálható meghatározására. Ezt a célkitűzést a találmány szerinti aktivitás-meghatározási eljárással oldottuk meg. A találmány tárgya eljárás a kimotripszin vagy a tripszin aktivitásának székletből végzett meghatározására, melynek során egy alkalmas szubsztrátumhoz a széklet vizes vagy vizes-metanolos szuszpenzióját adjuk és a szubsztrátum hasadási sebességét mérjük, azzal jellemezve, hogy a székletet valamilyen felületaktív anyag jelenlétében szuszpendáljuk. A szubsztrátum hasadási sebességének mérését a technika állásához tartozó bármelyik ismert módszerrel végezhetjük, ilyen módszer például a felszabaduló aminosav titrálása valamilyen lúgoldattal (pH-stat-eljárás). Kimutattuk, hogy amennyiben az eljárást a találmány szerinti valamilyen felületaktív anyag jelenlétében valósítjuk meg, úgy az enzimaktivitálsnak több mint 90%-a rendszerint szohibilizálódik, a szubsztrátum hasadási sebessége jelentékeny mértékben megnő és a szubsztrátum észlelhető Km-értéke lecsökken (aktivitásfaktor körülbelül 2-10), miáltal az eddig felmerült nehézségeket (így különösen az enzim kötődését a székletrészecskéken, továbbá a kezeletlen székletminták meglepően nagy Km-értékeit bizonyos szubsztrátumok esetében, a kristályos enzimhez viszonyítva) ki lehetett küszöbölni. Mindez kiváltképpen azért lehetséges, mert a szubsztrátum hasadásának sebességét fotometriás úton is meg lehet mérni; a mérés gyors, egyszerű, pontos és kevés szubsztrátummal is elvégezhető. Á találmány szerinti eljárással - vagyis valamilyen felületaktív anyag jelenlétiében - kapott eredmények különösen azért is meglepők, mert a szarvasmarha-pankreászból nyert tiszta a-kimotripszin alkalmazása esetén gyakorlatilag nem találtunk különbséget aszerint, hogy a meghatározási eljárást valamilyen felületaktív anyag jelenlétében vagy ilyen anyag nélkül végeztük. Felületaktív anyagként elvileg minden alkalmas tenzidet fel lehet használni, így anionos vagy amfolitikus tenzideket, de előnyösen nem ionos tenzideket és különösképpen kationos tenzideket alkalmazunk. Az anionos tenzidek például alkánszulfonátok, olefinszulfonátok, mint például kuménszulfonát, észterszulfonátok, alkil-aril-szulfonátok, főleg dodecil-benzolszulfonát típusú alkil-benzolszulfonátok és alkil-naftalinszulfonátok, alkil-szulfátok, mint például nátrium-lauril-szulfát, éter-szulfátok vagy zsíralkohol-szulfátok, továbbá a zsírsavak vagy a kólsav sói lehetnek. Az amfolitikus tenzidek re példaképpen az anionaktív és kationaktív hidrofil csoportokkal rendelkezőket említjük; ilyenek például á betainhoz hasonló szerkezettel rendelkező glicerinszármazékok, a szulfobetainok és a lecitinek. A nem ionogén tenzidek közé tartoznak például a poliéterek, így elsősorban az alkil-fenolpoliglikoi-éterek és a zsírsavak, a zsírsav-amidok, a hosszúszénláncú aminek („zsíraminok”) és a zsíralkoholok etoxilezése útján előállítható termékek, így például az etoxilezett lauril-alkohol, továbbá a propilénből és etilén-oxidból készült polimerek, a polioxietilén-alkil-éterek, vagy -nonil-fenil-éterek, a polioxietilén-szorbitán-monooleát vagy -laurát, a propilén-oxidból (etilén-diaminból) etilén-oxidból 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
