187388. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és preparátum agyi receptorokhoz kötődő anyagok mennyiségi meghatározására és eljárás a preparátum előállítására
1 187 388 2 A találmány tárgya eljárás és preparátum agyi receptorokhoz kötődő anyagok (elsősorban benzodiazepinek, ß-adrenerg blokkoló anyagok és y-amino-vajsav) mennyiségi meghatározására. A találmány továbbá a meghatározásban felhasználható preparátum előállítására vonatkozik. A gyógyászatban gyakran van szükség a testnedvekben lévő, agyi receptorokhoz kötődő anyagok mennyiségi meghatározására diagnosztikai és/vagy terápiás célból. így például a gerincfolyadék y-amino-vajsav-tartalmából egyes agyi megbetegedésekre lehet következtetni. Ismert az is, hogy a testnedvek a meghatározandó anyagot rendszerint igen kis (10“8-10-12 mólnyi) koncentrációban tartalmazzák, így mennyiségi mérésük speciális, érzékeny módszereket igényel. y-Amino-vajsav mennyiségi meghatározására alkalmas, tömegspektrometriás, nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás és ioncserés fluorometriás módszereket ismertetnek a következő közlemények: J. Chromat. 118, 395 (1976), Brain Res. 167, 297 (1979) és Anal. Biochemistry 101, 349 (1980). Noha a felsorolt módszerek megfelelően érzékenyek, közös hátrányuk, hogy a vizsgálandó biológiai mintát nem lehet a mérésben közvetlenül felhasználni, hanem csak. körülményes mintaelőkészítés (többlépéses tisztítás, származékkészítés stb.) után. A y-amino-vajsav mennyiségi meghatározására újabban kidolgozott radioreceptor teszt [J. Neurochem. 28, 1121 (1977), Brain Res. 182, 99 (1980), Clinica Chimica Acta 109, 77 (1981)] elvégzéséhez nincs szükség a vizsgálandó testnedv előkészitésére. Hátrányt jelent azonban, hogy a vizsgálat elvégzéséhez szükséges receptor szuszpenziót az ismert módszerek szerint kísérleti állatok agyából frissen kell elkészíteni. Ehhez állatház fenntartására és speciális biokémiai laboratóriumra van szükség, amelyekkel a kórházak és klinikák általában nem rendelkeznek. Olyan receptor preparátumra van tehát szükség, amely száraz állapotban korlátlan ideig eltartható, és megbízhatóan felhasználható az agyi receptorokhoz kötődő anyagok mennyiségi meghatározására. Egyszerűen kezelhető, korlátlanul eltartható, száraz receptor preparátum előállítását ismerteti a 29 02 071 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat. Az ismert eljárás szerint a receptor preparátumot úgy állítják elő, hogy állati agyszövetet egy közömbös, vízben oldódó anyag - célszerűen szacharóz - vizes oldatával homogenizálnak, és a homogenizátumot fagyasztva szárítják. Az ismert receptor preparátum hátránya azonban az, hogy csak benzodiazepinek mennyiségi meghatározására használható fel, és ezen belül sem alkalmas a különböző típusú benzodiazepinek elkülönített mérésére. Agyi receptorokhoz kötődő egyéb anyagok, például y-amino-vajsav és ß-adrenerg blokkoló anyagok mennyiségi meghatározása az ismert receptor preparátummal nem lehetséges. Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy ez a hiányosság annak tulajdonítható, hogy az ismert receptor preparátum az agyi receptorok túlnyomó részét endogén anyagok által inaktivált formában tartalmazza. Az inaktiváló endogén anyagok tökéletes eltávolításával az agyi receptor-helyek szabaddá tehetők, így a preparátum minden olyan anyag meghatározására alkalmassá válik, amely agyi receptorokhoz képes kötődni. A találmány tárgya tehát eljárás agyi receptorokhoz kötődő anyagok mennyiségi meghatározására alkalmas, stabil receptor preparátum előállítására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy egy vízben oldódó inert anyag vizes oldatával készített agy- vagy agyrészlet-homogenizátumot 800-1100 g gyorsuláson 8-20 percig centrifugálunk, a felülúszót elkülönítjük és 18 000-22 000 g gyorsuláson 10-20 percig centrifugáljuk, az így kapott szilárd anyagot desztillált vízben újrahomogenizáljuk, a homogenizátumot kívánt esetben lefagyasztjuk és felengedjük, ezután 7000-9000 g gyorsuláson 5-15 percig centrifugáljuk, a felülúszót elkülönítjük, 35 000-45 000 g gyorsuláson 20-30 percig centrifugáljuk, majd a kapott szilárd anyagot 6 és 8 közötti pH-értékű vizes pufferoldattal háromszor mossuk, a szilárd anyagból és mosófolyadékból álló szuszpenziót legalább egyszer lefagyasztjuk és felengedjük, majd 35 000-45 000 g gyorsuláson 20-30 percig centrifugáljuk, végül a szuszpenziót fagyasztva szárítjuk. Ezzel az eljárással olyan szilárd, stabil, korlátlan ideig tárolható receptor preparátumot kapunk, amely az összes agyi receptorhelyet aktív állapotban tartalmazza, és radioreceptor tesztben általánosan alkalmazható minden agyi receptorokhoz kötődni képes anyag mennyiségi meghatározására. Kiindulási anyagként célszerűen állati (patkány, marha, csirke stb.) agyat használunk fel, amelyből a 29 02 071 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratban ismertetett módon készítünk agyhomogenizátumot. A vizes közeghez vízben oldódó inert anyagként előnyösen szacharózt adunk. Az első, 800-1100 g gyorsuláson végzett centrifugálással a durva üledéket különítjük el az agy- vagy agyrészlet-homogenizátumból; a receptor preparátumot tartalmazó anyagot ekkor a felülúszó tartalmazza. A felülúszóból a második, 18 000-22 000 g gyorsuláson végzett centrifugálási lépéssel különítjük el a receptor preparátumot tartalmazó anyagot sejtmagokkal és mitochondriummal szennyezett állapotban. A receptor preparátumot tartalmazó anyag ebben a lépésben az aktív receptor-helyek túlnyomó többségét még endogén anyagok által inaktivált állapotban tartalmazza. Ezt a szilárd anyagot ezután desztillált vízben újrahomogenizáljuk. Ekkor a sejtmembránok felpattannak, és az aktív receptor-helyeket blokkoló endogén anyagok a vizes közegbe jutnak. Az újrahomogenizálást célszerűen hideg (4-10 °C-os) desztillált vízben végezzük. 1 súlyrész szilárd anyag újrahomogenizálásához célszerűen legalább 15 súlyrész desztillált vizet használunk fel. Általában minél nagyobb mennyiségű vizzel végezzük az újrahomogenizálást, annál jobb hatásfokkal távolíthatjuk el a blokkoló endogén anyagokat az aktív receptorhelyekről. A desztillált víz mennyiségének felső határát lényegében gazdaságossági szempontok szabják meg. 1 súlyrész szilárd anyag újrahomogenizálásához rendszerint 10-20 súlyrész desztillált vizet használunk fel. 5 .10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
