187388. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és preparátum agyi receptorokhoz kötődő anyagok mennyiségi meghatározására és eljárás a preparátum előállítására
1 187 388 2 A desztillált vizes homogenizátumot a sejtmembránok felpattanásának elősegítése céljából kívánt esetben lefagyaszthatjuk, majd felengedjük. A desztillált vizes homogenizátumból az első, 7000-9000 g gyorsuláson végzett centrifugálással a sejtmagokat és a mitochondriumot távolítjuk el, amelyek aktív receptor-helyeket nem tartalmaznak, és jelenlétük károsan befolyásolná a receptor preparátum tulajdonságait (pl. szűrhetőségét). A felülúszóból különítjük el a következő, 35 000-45 000 g gyorsuláson végzett centrifugálással a preparátum alapanyagát, amit ezután 6 és 8 közötti pH-értékű vizes pufferoldattal - célszerűen trisz-citrát pufferoldattal (pH = 7,1) - legalább egyszer mosunk. A mosófolyadékból és szilárd anyagból álló szuszpenziót legalább egyszer lefagyasztjuk és felengedjük, majd centrifugáljuk. A kapott szilárd anyagot ismert mennyiségű és sótartalmú vizes pufferoldatban szuszpendáljuk. Ezt a szuszpenziót fagyasztva szárítjuk. Az így előállított stabil, szilárd receptor preparátumot a következőképpen használhatjuk fel agyi receptorokhoz kötődő anyagok mennyiségi meghatározására: A radioaktívan (rendszerint triciummal) jelzett vizsgálandó anyagot tartalmazó vizes oldathoz hozzáadjuk a receptor preparátum 6 és 8 közötti pH-értékű vizes pufferoldattal vagy desztillált vízzel készített szuszpenzióját. Az elegyet inkubáljuk, majd a szilárd anyagot leszűrjük, pufferoldattal mossuk, és meghatározzuk a szilárd anyag radioaktivitását. Ezután a radioaktívan jelzett vizsgálandó anyagot hordozó receptor preparátumhoz ismert mennyiségű, nem radioaktív vizsgálandó anyagot adunk, az elegyet inkubáljuk, a szilárd anyagot leszűrjük, pufferoldattal mossuk, és radioaktivitását újból megmérjük. Az utóbbi műveletet változó, ismert mennyiségű nem radioaktív vizsgálandó anyag felhasználásával többször megismételjük. A mérési eredmények alapján koncentráció/radioaktivitás kalibrációs egyenest veszünk fel (a „koncentráció” megjelölés a nem radioaktív vizsgálandó anyag koncentrációját jelenti). A testnedvben (például gerincfolyadékban) lévő vizsgálandó anyag mennyiségét a fentiek szerint szerkesztett kalibrációs egyenes segítségével határozzuk meg úgy, hogy a radioaktívan jelzett vizsgálandó anyagot hordozó receptor preparátumhoz ismert mennyiségű testnedvet adunk, az elegyet inkubáljuk, a szilárd anyagot leszűrjük, mossuk, radioaktivitását mérjük, és a mért értékhez tartozó koncentrációt leolvassuk a kalibrációs egyenesről. A találmányt az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa Receptor preparátum előállítása CFY törzsbeli hím patkányokat dekapitálunk. Agyukat azonnal eltávolítjuk, és jeges fiziológiás konyhasóoldattal mossuk. A hídnak nevezett agyrészletet és a nyúltagyat eltávolítjuk, és a maradékból 15-szörös térfogatú 0,32 mólos vizes szacharózoldattal homogenizátumot készítünk. A homogenizátumot 10 percig 1000 g gyorsuláson centrifugáljuk, majd a felülúszót elkülönítjük, és 10 percig 20 000 g gyorsuláson centrifugáljuk. Az elkülönített szilárd anyagot 15-szörös térfogatú hideg ( + 4 °C-os) desztillált vízben újrahomogenizáljuk, majd a homogenizátumot 8000 g gyorsuláson 10 percig centrifugáljuk. A felülúszót elkülönítjük, és 40 000 g gyorsuláson 20 percig centrifugáljuk. A kapott szilárd anyagot 50-szeres térfogatú 50 mmólos trisz-citrát-pufferoldatban (pH = 7,1) homogenizáljuk, és a szuszpenziót 40 000 g gyorsuláson újra centrifugáljuk. Az utóbbi mosási lépést megismételjük. A szilárd anyagot ezután tízszeres térfogatú pufferoldatban szuszpendálva lefagyasztjuk, és 10 órán át -20 °C-on tároljuk. A szuszpenziót felengedni hagyjuk, desztillált vízzel ötszörösére hígítjuk, majd 40 000 g gyorsuláson újra centrifugáljuk. Ezt a lefagyasztás- felengedés-centrifugálás ciklust háromszor megismételjük. Az utolsó felengedés után a szuszpenziót részekre osztva lefagyasztjuk és fagyasztva szárítjuk. Por alakú receptor preparátumot kapunk, amit felhasználás (mérés) előtt pufferoldattal vagy desztillált vízzel keverünk össze. A por alakú receptor preparátum évekig eltartható változás nélkül. 2. példa Kalibrációs görbe felvétele radioreceptor teszthez A kalibrációs görbe felvételéhez a következő öszszetételü oldatokat, ill. szuszpenziókat használjuk fel: I.a. oldat: 0,7435 g NaCl, 0,0186 g KC1, 0,0144 g CaCl2, 0,012 g MgS04 100 ml kétszer desztillált vízben oldva I. b. oldat: 1 g marha szérumalbumin 10 ml I.a. oldatban oldva II. a. oldat: 1 mg y-amino-vajsav 1000 pl V. oldatban oldva Il.b. oldat: 10 pl II.a. oldat és 10 ml V. oldat elegye II.c. oldat: 100 pl II.b. oldat és 900 pl V. oldat elegye H.d. oldat: 750 pl II.c. oldat és 250 pl V. oldat elegye Il.e. oldat: 500 pl II.c. oldat és 500 pl V. oldat elegye II.f. oldat: 250 pl II.c. oldat és 750 pl V. oldat elegye II. g. oldat: 100 pl II.c. oldat és 900 pl V. oldat elegye III. szuszpenzió: 0,2 g, az 1. példa szerint készített receptor preparátumot 3 ml kétszer desztillált vízben szuszpendálunk, majd a szuszpenziót 17 ml V. oldattal hígítjuk IV. oldat: 40 nCi/500 pl aktivitású 3H-y-aminovaj sav-oldat (oldószer: pH = 4 értékű vizes sósavoldat) V. oldat: 50 mmólos trisz-citrát pufferoldat (pH = 7,1) (a) Teljes kötőkapacitás (Cc érték) meghatározása: Sorrendben a következő oldatokat, ill. szuszpenziÓKat elegyítjük: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
