187372. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a C-15003 P-O antibiotikum előállítására
1 187 372 2 leirt módon vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokat végeztünk. Az új C-15003 P-3, P-3’ és/vagy P-4 antibiotikumokat a kapott táptalajon termeljük és gyűjtjük össze, extra- és intracellulárisan egyaránt. Ezeket az anyagokat vékonyrétegkromatográfiásan is kimutattuk. így a fermentlét sejtekre és szürletre különítettük el szűréssel vagy centrifugálással és a szürletet azonos mennyiségű etilacetáttal extraháltuk. A sejtekhez ugyanolyan mennyiségű 70%os aceton-víz elegyet adunk mint a szűrlethez és egy órás, 20 °C-on végzett keverés után a szuszpenziót szűrtük. Az acetont eltávolítottuk a szűrletből és a kapott vizes szűrletet etilacetáttal extraháltuk. Valamennyi extraktumot 1/100 térfogatra koncentráltunk és vékonyrétegkromatográfiás méréssel vizsgáltunk, szilikagél lemezen (Merck, NSZK, Kieselgel 60 F 254, 0,25 mm, 20 x 20). Oldószerrendszerként kloroform és metanol 9 : 1 arányú elegyét használtuk. A potenciált a foltok intenzitásának alapján határoztuk meg, amit 2537 Á-nél ultraibolyafénnyel végzett besugárzással határoztunk meg. Miután a C-15003, P-3, P-3’ és/vagy P-4 antibiotikumok, melyeket a fermentlében a fentiek szerint állítunk elő, semleges anyagok, könnyen kinyerhetők általánosan használt elkülönítési és tisztítási eljárásokkal, amelyeket rendszerint ilyen típusú szervezetek begyűjtésére alkalmazunk. így például használhatjuk azt az eljárást, amely az antibiotikum és a szennyezések oldhatóságában mutatkozó különbséget hasznosítja, azaz, amely a különféle adszorbensekkel szemben mutatott adszorptív affinitást hasznosítja (ilyen adszorbensek lehetnek például: aktív szén, makroporózusos, nem-ionos gyanták, szilikagél, aluminiumoxid). A szennyezések ezen kívül ioncserélő gyantákkal és más módszerekkel is eltávolíthatók, amelyeket egymagukban vagy alkalmas kombinációban, adott esetben ismételten is alkalmazunk. Miután az említett C-15003 P-3, P-3’ és P-4 antibiotikumok a szűrletben és a sejtekben egyaránt előfordulnak, az antibiotikumok elkülönítése és tisztítása ilyen adszorbensek segítségével, ha használatukra egyáltalán sor kerül, történhet akár közvetlenül, akár - szűrlet esetében - oldószeres extrakció, vagy - mikrobás eredetű sejtek esetében - oldószeres extrakció után. Az oldószeres extrakciót a következő módszerek bármelyike szerint végrehajthatjuk: 1. a fermentlé oldószeres extrakciója a sejtek elkülönítése előtt, 2. a sejtek és a szűréssel, centrifugálással vagy más módszerekkel kapott szűrlet oldószeres extrakciója. A szürlet és a sejtek független extrakciójára előnyösen a következő eljárást használjuk. A szűrlet extrakciójára alkalmas oldószerek vízzel nem elegyedő, szerves oldószerek, így zsírsavészterek, például etilacetát, amilacetát; alkoholok, például butanol; halogénezett szénhidrogének, például kloroform és ketonok, például metil-izobutilketon. Az extrakciót semlegeshez közeli pH-értéken hajtjuk végre és előnyösen, az előzőleg pH 7-re beállított folyékony fermentlét etilacetáttal extraháljuk. Az extraktumot vízzel mossuk és csökkentett nyomáson koncentráljuk. Ezután egy nem poláros oldószert, így petrolétert vagy hexánt adunk a k oncentrátumhoz és a hatóanyagot tartalmazó nyersterméket kinyerjük. Mivel vékonyrétegkromatográfiás mérések szerint a C-15003 mellett számos más foltot is kapunk, az I általános képletű terméket több lépcsőben a következő tisztítási eljárásokkal dolgozzuk fel. így szokásos tisztítási eljárásként adszorpciós kromatográfiát használhatunk erre a célra, adszorbensként a szokásos adszorbensek valamelyikét, így szilikagélt, alumíniumoxidot, makropórusos nem-ionos adszorbens gyantát alkalmazhatunk. Az (I) általános képletű vegyületek nyers formájának tsztítására legelőnyösebb a szilikagél használata. Az előhívást például úgy hajthatjuk végre, hogy petroléterrel és hexánnal indulunk és a C-15003 antibiotikum eluálását valamely poláris oldószerrel, úgy mint etilacetáttal, acetonnal, etanollal vagy metanollal végezzük. Egy szokásos, eljárás szerint, vivőanyagként szilikagélt használva (Merck, NSZK, 0,05-0,2 mm), az oszlopkromatográfiát úgy végezzük, hogy a hexán : etilacetát arányt fokozatosan növeljük. Az eluátumból mintát veszünk, amelyet vékonyrétegkromatográfiásan vizsgálunk meg és a C-15003-at tartalmazó frakciók it összegyűjtjük és csökkentett nyomáson koncentráljuk. Ezután a koncentrátumhoz petrolétert vagy hexánt adunk, miáltal (II) képletű nyersterméket kapunk, Mivel ez a termék még tartalmaz szennyezéseket, a következőképpen tovább tisztítjuk. A (II) képletű vegyületet például szilikagél oszlopon tisztíthatjuk, különféle oldószerrendszereket használva. Az erre a célra használt előhívórendszer egy halogénezett szénhidrogénből, így diklói metánból vagy kloroformból állhat, egy poláris oldószer, úgy mint alkohol, például metanol vagy etí nol, keton, például aceton vagy metiletilketon vagy más hasonló oldószerek hozzáadása mellett. E2el a módszerrel elkülönítjük a C-15003 antibiotikumot. Az első és második szilikagél oszlopra felvitt oldószerek sorrendje megfordítható, és szükség esetén a fenti rendszerekkel együtt még más szokásom szerves oldószerek is használhatók. Ha makropórusos adszorbens gyantát használunk a tisztítás eszközéül a (II) képletű termék tisztítása során, a C-15003 antibiotikum eluálását víz és egy rövidszénláncú alkohol, rövidszénláncú keton vagy észter elegyével végezzük. A rövidszénláncú alkohol lehet például metanol, etanol, propanol vagy butanol, és a rövidszénláncú keton lehet pé dául aceton vagy metiletilketon. Észterként például etilacetátot használhatunk. Egy tipikus eljárás szerint a (II) képletű termékét feloldjuk egy 60%-os metanol-víz elegyben és egy Diaion HP-Í0 (Mitsubishi Kaséi K. K.) elegyen adszorbeáljuk. Az oszlopot egy 70%-os metanol-víz eleggyel mossuk, majd az eluálást 90%-os metanol-víz eleggyel hajtjuk végre. Ezzel az eljárással a C-15003 antibiotikumot eluáljuk az oszlopról. Bármelyik fent leírt eljárásban a C-15003 antibiotikumot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és csökkentett nyomáson koncentráljuk. A száraz termékhez 5-8 térfogatrész etilacetátot adunk, és az elegyet állni hagyjuk, majd elkülönítjük a C-15003 antibiotikum kristályait. Ezek a kristályok 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
