187372. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a C-15003 P-O antibiotikum előállítására
1 2 187 m Megjegyzés: + + + : kiváló növekedés + +: jó növekedés + : növekedés ± : rossz növekedés - : nincs növekedés 6. Egyéb jellemzők A sejteket a korábban, a 2. pont alatt leírt módszerrel gyűjtöttük össze, és a DNA preparációját J-Marmur és mtsai (Journal of Molecular Biology 3, 208 [1961]) módszeréhez hasonló módon végeztük. A DNA (dezoxinukleinsav) G-C (guanin-citozin) tartalmát körülbelül 71 mól%-nak találtuk. A törzs vegetatív micéliumának Gram-vizsgálata pozitív eredményt adott. A C-15003 törzs fenti jellemzőit összevetettük az S. A. Waksman „The Actinomycètes Vol. 2” (The Williams and Wilkins Co. [1961]) könyvében, valamint R. E. Buchanan és N. E. Gibbons „Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiadás 1974” című kiadványával és más irodalmi adatokkal. Miután a törzset a Nocardia genus III. csoportjába tartozónak véltük, az a tény, hogy az ismert törzsek között nem találtunk olyat, amelynek a tulajdonságai azonosak lettek volna, arra a következtetésre kellett jutnunk, hogy az általunk vizsgált törzs egy új speciest képvisel. A C-l 5003 számú törzset 3992 szám alatt letétbe helyeztük a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology mikroorganizmus gyűjteményében (FERM); míg a törzs a The Institute for Fermentation, Osaka (EFO) gyűjteményében az IFO 13 726 számot és a The American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, USA gyűjteményében a 31 281 számot kapta. Míg a C-l 5003 törzs a Nocardia genus egy új species-e, mint említettük, a többi mikroorganizmushoz hasonlóan hajlamos különböző változatok és mutánsok kialakítására akár spontán módon, akár mutagének hatására. így például a törzs sok variánsát kaphatjuk röntgensugarakkal végzett besugárzás hatására vagy gamma-sugarak, ultraibolya sugarak hatására, egysejtes izolálással, különböző vegyszereket tartalmazó táptalajokban végzett tenyésztéssel vagy bármely egyéb mutagén kezeléssel. A törzsből spontán módon keletkezett mutánsokat ugyancsak nem tekintjük külön speciesnek, ellenkezőleg, bármely ilyen változat vagy mutáns, amely alkalmas a C-l5003 P-3, P-3’ és/vagy P-4 antibiotikumok termelésére, felhasználható a találmány céljaira. így például a C-l5003 törzset különféle mutagogén kezeléseknek alávetve olyan mutánsokat kapunk, amelyeknél lényegében hiányzik az oldható pigment termelő képesség, amelyekben a micéliumok színtelenek, sárgászöldek, vöröses cserszínűek vagy narancsvörösek, más mutánsok gombasejtjei bacillusszerű elemekre vagy elágazó, rövid sejtekre képesek felhasadni, ismét másik kevés fehér aerob micéliumot tartalmaznak, vagy lényegében légmicélium nélküliek. Az ilyen, C-l 5003 antibiotikumot termelő törzsek tenyésztésére felhasznált táptalaj bármely cseppfolyós vagy szilárd táptalaj lehet, azzal a feltétellel, hogy olyan tápanyagokat tartalmaz, amelyeö két a törzs hasznosítani képes, bár nagyüzemi termelés esetében a folyékony táptalajok használata kedvezőbb. A táptalajok tartalmazhatnak nitrogén- és szénforrásokat, amelyeket a C-l 5003 számú mikroorganizmus képes asszimilálni és emész- Q teni, szervetlen anyagokat, nyomnyi mennyiségű tápsókat és egyéb anyagokat. Szénforrásként például a következő anyagokat használhatjuk: glükóz, laktóz, szaccharóz, maltóz, dextrin, keményítő, glicerin, mannitol, szorbitol, zsírok és olajok (például . szójabab olaj, disznózsír, csirkezsír). Nitrogénforrásként például a következő vegyületeket használhatjuk: hús extraktum, élesztő extraktum, szárított élesztő, szójabab liszt, kukoricacsávázó folyadék, 20 pepton, lenmag liszt, maláta hulladék, karbamid, u ammóniumsók (például ammóniumszulfát, ammóniumklorid, ammóniumnitrát, ammóniumacetát). A táptalaj ezen felül tartalmazhat nátrium-, kálium-, kalcium-, magnézium- és egyéb sókat, így vas-, mangán-, cink-, kobalt-, nikkelsókat, foszfor- 5 sav-, bórsav-sókat és szerves savak sóit, így acetátokat és propionátokat. A táptalaj ezen kívül tartalmazhat még különféle aminosavakat (például glutaminsav, alanin, glicin, lizin, metionin, prolin), peptideket (például dipeptidek, tripeptidek), vita- 3 minokat (például Bl5 B2 vitaminok, nikotinsav, B12, C és E vitaminok), nukleinsavakat (például purin, pirimidin és származékaik). A táptalaj pH- értékének beállítása céljából egy szervetlen vagy szerves savat, lúgot, puffereket és hasonló anyago- 35 kát adhatunk a rendszérhez. Habzásgátlóként olajok, zsírok, felületaktív szerek és más megfelelő anyagok alkalmas mennyiségeit használhatjuk. A tenyésztést bármely stacioner, rázó, merülő aerob és más módszerrel végezhetjük. Nagyüzemi 0 termelésre természetesen a merülő aerob tenyészetek a legalkalmasabbak. Míg a tenyésztés körülményei természetesen függnek a táptalaj összetételétől, a törzstől, az alkalmazott módszertől és más tényezőktől, általában az inkubálást előnyösen 20 45 és 35 °C között, megközelítőleg 7,0 kezdeti pH- érték mellett végezzük. Különösen kívánatos, hogy a hőmérséklet 23 és 30 °C között legyen a tenyésztés közbenső szakaszában és a kezdeti pH-érték 6,5 és 7,5 között változzon. Bár az inkubálás ideje szintén 50 a fenti tényezők függvénye, tanácsos az inkubálást addig végezni, míg a kívánt antibiotikum titer-értéke maximális nem lesz. Rázó kultúrák vagy aerob merülő tenyészetek esetében ez az idő általában 48-144 óra között van. 55 Az antibiotikum hatásosságát Tetrahymena pyiformis W-al vizsgáltuk. így, a fenti mikroorganizmust egy vizsgálati táptalajon (20 g proteóz-pepton [Difco], 1 g élesztő extraktum [Difco], 2 g glükóz, 1000 ml desztillált víz és 10 ml 1 mól 1 1-es foszfát 60 puffer [pH 7]) 28 °C-on, 44-48 órán át tenyésztettük és az antibiotikum potenciálját sorozat hígitásos módszerrel határoztuk meg, nyomon követve a zavarosodás változását, megvizsgáltuk a hasvízkór daganatsejtjeire kifejtett hatását és a későbbiekben 65 4
