187334. lajstromszámú szabadalom • Készítmény észteráz és/vagy proteáz enzimek kimutatására és eljárás megfelelő szubsztrátum előállítására
187 334 2 A II es III általános képletű észtereket észterázok és/vagy proteázok, például a neutrofil granulocitákban előforduló észterázok és proteázok gyorsan és teljesen elszappanositják. A szabaddá való fenolkomponensek jól. gyorsan és szelektíve reagálnak az I általános képletű kevéssé elektrofil diazóniumsokkal. igy a találmány szerinti stabil kés/itménynyet a íeukociták gyorsan kimutathatók testfolyadékokban.-hzenkívül kiderült, hogy a találmány szerinti készítmények kiválóan alkalmasak proteo- Iítikus enzimek, például elasztáz, kimotripszin vagy tnps/in vizes oldatokban, illetve tesUÖlyadékokoan, például teljes vérben, szérumban és liquorban, pankreás/valadékban vagy vizes székletkivonatokoan való kimutatására. Az í általános képletű diazóniumsók részben ssmert vegyüietek. Az olyan származékok, amelyek fépleteben R3 jelentése tioraorfolino-, 1-pirrolidinil-. adott esetben 4-helyzetben alkilezett piperazinii vagy píperidinocsoport, új vegyüietek. Ezek azonban az ismert vegyüietek analógiájára önma—jKoan ismert módszerekkel előállíthatok. 11 altalános képletű vegyületeket 180 431 sz. magyar s/.aoadalmi leírás ismerteti. A ill általános képletű észterek új vegyüietek. Ezek úgy állíthatók elő, hogy IV általános képletű vegyületeket - amelyek képletében Rá Rá Rj és R4 clente.se az előbb megadottakkal azonos - V általános képletű aminosavakkal - amely képletben A' és B' jeienlese az előbb megadottakkal azonos .llelve ezek alkalmas reakcióképes származékaival reagáitatjuk a peptidkémiában szokásos módszerekkel. Reakcióképes származékokként például a savkloridok, illetve a petidszintézisnél általában alkalmazott, például klór-hangyasav-etil-észterrel képzett vegyes anhtdridek vagy aktív észterek reagál-, láthatók. A találmány további tárgyát képezi a III általános képletű új észterek előállítási eljárása. Az Rt, es R3, illetve R,, R2, R3 és R4 szubsztituensek meghatározásánál halogénatomon fluor-, klór-, bróm- és jódatom, előnyösen klór- és brómatom értendő. Az R,-R5, R,-R4 valamint R/-R4 szubsztituensek meghatározásánál említett alkil-, alkoxi-, alkiltio-, alkil-amtno- és dialkil-amino-esoportok közül legelőnyösebbek a metilcsoportot tartalmazók. Az A meghatározásánál megadott aminosavgyökök közül mindenkor az L-alak előnyös. A találmány szerint alkalmazott I általános képletű diazómumsókat és a II és III általános képletű észtereket 10 10 1 mól/líter, előnyösen 10 J— 10 ”2 mól/liter koncentrációban adjuk az impregnálóoldat-bevonómasszához vagy a vizsgálandó folyadékhoz. A proteolitikus enzimek és különösen a leukocita-proteázok kimutatására szolgáló találmány szerinti készítmény további alkotórésze egy alkalmas pufferrendszer. Erre a célra például foszfát-, borát-, barbiturát-, trisz(hidroxi-metil)-amino-metán( — IRIS), 2-amino-2-metil-l,3-propándiol(=Amediol) vagy aminosav-pufterok jönnek számításba, amelyeknél a pH-értéket és kapacitást úgy 4 kési megválasztani, hogy a mérőoldatban illetve a tesztcsíkon 6-10, előnyösen 7-9 pH-érték álljon be. \ proteolitikus enzimek kimutatására szolgáló találmány szerinti készítmény további alkotórésze lelet még egy nedvesítőszer, mivel ezáltal homogénebb színeloszlás és részben ragyogóbb színek érhető;: el. Alkalmazhatók kationaktív, anionaktív valamint am főtér és nem-ionos nedvesítőszerek 0,05-2% (súly. t0, előnyösen 0,1-1% (súly/tf) koncé ítrációban. A VI általános képletű foszfor- és foszfonsavamidok ismert vegyüietek, amelyeket például a 22 35 127 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírásban írnak le stabilizátorokként olyan te ztcsík-receptekhez, amelyek peroxidázkimutatás alapján működnek. A VI általános képletű vegyüietek segítségével a re;eptúrák meglepően jól stabilizálhatok. A VI általános képletű foszfor- és foszfonsavai tid típusú stabílizátorokat a vizes vagy előnyösen a szerves impregnálóoldathoz 1-20% (súly/tf), előnjösen 5-15% {súly/tf) koncentrációban adjuk hozzá. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a proteolitikus enzimek, különösen proteolitikus leukocitaei zimek kimutatására szolgáló találmány szerinti diagnosztikai készítmény reakcióidői jelentősen megrövidíthetek, ha a diazóniumsókon, észtereken és eddig felsorolt segédanyagokon kívül egy vagy t( bb aktivátort is hozzáadunk, A találmány szerinti készítményhez alkalmas aktivátoroknak a 1 ;2 102 sz. magyar szabadalmi leírásban leírt és felhasznált vegyüietek bizonyultak. Az aktivátorokat 0,5-10% (súly/tf), előnyösen I 5% (súly/tf) koncentrációban használjuk az impn gnálóoldatban. A találmány szerinti készítmények előállítása célj; bó! például szívóképes hordozókat, előnyösen s 'ürőpapírt, cellulózt vagy müanyagrostfilcet a szükséges, a tesztcsíkok előállításához szokásosan a kaimazott reagensek (szubsztrát, puffer, adott esetben nedvesítőszerek) könnyen illő oldószerekkel, például vízzel, metanollal, etanollal, vagy acet mnal készített oldataival impregnáljuk. Ez célszerűen két külön szakaszban történik: először valamilyen vizes oldattal impregnálunk, amely a puffert és más vízoldható anyagokat tartalmazza, utána a II illetve III általános képletű proteáz-szubsztrátbk, I általános képletű diazóniumsók és aktivátotok oldatával impregnálunk. Az impregnálás véj ezhető azonban más sorrendben illetve két másfajta összetételű impregnálóoldattal is. A kész tesztpapírok így is használhatók, vagy ismert módon fogókra ragasztva vagy előnyösen a 21 18 455 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerint műanyag és finomlyukú háló közé behegesztve. Filmmel bevont tesztcsíkok előállítására az öszszes reagenst egy filmképző anyag - igy például polivinilészter vagy poliamid - oldatába vagy diszperziójába adagoljuk, majd alaposan összekeverjük. A keveréket vékony rétegben műanyag hordóéra kenjük, majd szárítjuk. A találmány szerinti, ilmmel bevont tesztcsíkokat száritás után felváguk és mint ilyeneket használjuk, vagy önmagában 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
