187334. lajstromszámú szabadalom • Készítmény észteráz és/vagy proteáz enzimek kimutatására és eljárás megfelelő szubsztrátum előállítására
1 187 334 2 ismert módon fogókra ragasztjuk vagy például műanyag és finomlyukú háló közé hegesztjük, a 21 18 455 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerint. A proteolitikus enzimek, különösen a leukocitaproteázok kimutatására szolgáló találmány szerinti diagnosztikai készítmény porkeverékek vagy reagenstabletták formájában is elkészíthető, amennyiben a teszt fent felsorolt alkotórészeit szokásos galénuszi adalékanyagokkal elegyítjük és granuláljuk. Ilyenfajta adalékanyagok például szénhidrátok, azaz mono-, oligo- vagy poliszacharidok vagy cukoralkoholok, azaz mannit, szorbit vagy xilit vagy más oldható inert vegyületek, mint a polietilén-glikolok vagy polivinil-pirrolidon. A porkeverékek vagy reagens tabletták végső súlya általában körülbelül 50-200 mg, előnyösen 50-80 mg. Körülbelül 5-20 mg, előnyösen körülbelül 10 mg összsúlyú liofilizátumok készítése céljából fagyasztva szárítunk olyan oldatot, amely a teszthez szükséges szokásos reagensek mellett egyéb szokásos vázképzőket, például polivinil-pirrolidont és esetleges további töltőanyagokat, például mannitot, szorbitot vagy xilitet is tartalmaz. A találmány szerinti diagnosztikai készítmény oldat formájában előnyösen a teszthez szükséges összes reagenst tartalmazza. Oldószerként víz vagy viznek vízzel elegyedő szerves oldószerekkel, például metanollal, etanollal, acetonnal vagy dimetilformamiddal készült elegyei jönnek számításba. Eltarthatósági okokból előnyös lehet, ha a teszthez szükséges reagenseket két vagy több oldatra osztjuk szét, amelyeket csak a tulajdonképpeni vizsgálatnál egyesítünk. Az így előállított diagnosztikai készítmények lehetővé teszik, hogy vizsgálandó testfolyadékba való bemártás vagy a vizsgálandó testfolyadék hozzáadása után proteolitikus enzimek, különösen a leukocita-proteázok jelenlétét gyorsan és egyszerűen olyan színképződés útján észleljük, amely vizuálisan vagy fotometriásan, például remissziós fotometriásan vagy küvettában kiértékelhető. Mivel a sejtenkénti ieukocita-proteáz aktivitás lényegében állandó nagyságúnak tekinthető, a színképződés intenzitásából a vizsgált testfolyadék leukocitakoncentrációjára következtethetünk. A találmány szerinti diagnosztikai készítmény mind intakt, mind lizált leukocitákhoz alkalmazható, mert a leukocita-proteázok aktivitása a leukociták lízise után is teljes egészében megmarad. Lízis-hiba következésképpen nem lép fel. I. példa Szűrőpapírt (például Schleicher und Schüll 23SL) egymásután a következő oldatokkal impregnálunk, és utána 60 °C-on megszárítjuk: 1. oldat: 0,2 mólos bórax-sósav puffer, pH 8, 10% foszforsav-trimorfolid. 2. oldat: 2 x 10 3 mól/liter szubsztrát, 10 I. 2 mól/liter diazóniumsó oldva acélon/1-dekanol (98 : 2) elegyben. Szubsztrátok: S1: 3-(N- tozil-L-alaniloxi)-indol, S2: 3-(Ntozil-L-alaniloxi)-l-metoxi-naftalin, S3: 1-(N- tozil-L-alaniloxi)-4-metoxi-naftalin, S4: l-(N-tozil-L-alaniloxi)-4-izopropoxi-naftalin, S5: l-(N-tozil-L-alaniloxi)-4-pentil-oxi-naftalin, S6: l-(N-tozil-L-alaniloxi)-3-(dimetil-amino)benzol, S7: l-(N-tozil-L-alaniloxi)-3-(dietil-amino)-benzol, S8: l-(N-tozil-L-alaniloxi)-3,5-dimetoxi-benzol, S9: 1 -(N-tozil-L-alaniloxi)-3-metil-5-metoxibenzol. Diazóniumsók: D1: 2,4-dimetoxi-benzol-diazónium-tetrafluoroborát, D2: 4-metoxi-naftalin-l-diazónium-tetrafluoroborát, D3: 2,5-dimetoxi-4-(dimetil-amino)-benzol-diazónium-tetr ifluoro-borát, D4: 4-(diinetil-amino)-benzol-diazónium-tetrafluoro-borát. így olyan papírokat kapunk, amelyek 100 leukocita/pl leukocita-tartalmú vizeletbe való bemártáskor körülbelül 3 perc elteltével a táblázatban felsorolt színekre színeződnek. A kiértékelés remissziós fotometri isan is történhet. Szubsztrát Diazóniumsó Szín SÍ Dl vörös-barna SÍ D2 vörös-barna SÍ D3 kék-szürke SÍ D4 zöld S2 Dl vörös S2 D2 világosvörös S2 D3 ibolya S2 D4 lila S3 Dl vörös-ibolya S3 D2 ibolya S3 D3 kék-szürke S4 Dl lila S5 Dl lila S6 Dl világosvörös S7 Dl világosvörös S8 Dl vörös-ibolya S9 Dl vörös-barna 2. példa Szűrőpapírt egymásután a következő oldatokkal impregnálunk, és 60 °C-on megszárítjuk. 1. oldat: 0,1 mólos borát-puffer, pH 8. 2. oldat: 2x 10~J mól/liter 2-metoxi-4-morfolino-benzoldiazónium-tetraklór-cinkát, 2 x 10~3 mól/liter szubsztrát*, 10% foszforsav-trimorfolid etanol/l-iekanol (98 : 2) elegyben oldva. * szubsztrá ok: A: 3-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-indol, í 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
