187334. lajstromszámú szabadalom • Készítmény észteráz és/vagy proteáz enzimek kimutatására és eljárás megfelelő szubsztrátum előállítására
1 187 334 2 A találmány tárgya készítmény leukocitákban lévő észteráz és/vagy proteáz enzimek kimutatására és eljárás megfelelő szubsztrátum előállítására. A vese és az urogenitális traktus megbetegedéseinek diagnosztikájában a leukociták vizeletben való kimutatása nagy jelentőséget kap. Ezt a kimutatást eddig mikroszkópiásan végezték, amennyiben mikroszkóp alatt megszámolták egy meghatározott vizelettérfogatban lévő leukocitákat. Ez a módszer azonban nagyon időigényes, fáradságos és fárasztó, és emellett iskolázott személyzet alkalmazását igényli. Egy idő óta ezért azzal próbálkoznak, hogy leukociták különböző testfolyadékokban való kimutatásának alapjául enzimes reakciókat alkalmazzanak, mivel a leukociták kiterjedt enzimspektrummal rendelkeznek. Leukociták testfolyadékokban való kimutatására szolgáló készítmények, amelyekben a leukocitákban előforduló észterolitikus és/vagy proteolitikus aktivitást használják fel analitikai célokra, a 28 26 965. és 28 36 644. sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságrahozatali iratokból már ismertek. Szulfonftalein-észtereket illetve azoszínezékésztereket alkalmaznak szubsztrátokként a leukocita-észterázokhoz és/vagy -proteázokhoz. Az enzimes reakciónál szabaddá váló színezékeket általánosan ismert módszerek szerint mérjük. Az ezekben az iratokban leírt készítmények még túl érzéketlenek. Reakcióideik túl hosszúak az alsó kimutatási határra, úgy, hogy a gyakorlati alkalmazás még bizonyos hátrányokkal jár, mindenekelőtt a vizsgálat kivitelezésénél túl hosszú várakozási időkkel. Proteázok és észterázok kimutatására különböző módszerek ismeretesek a hiszto- és citokémiai enzimológiából (lásd például: A. G. E. Pearse, Histochemistry, Theoretical and Applied, 3. kiadás, Churchill Livingstone, Edinburgh-London-New York 1968). Lényegében ezeknél szintén színtelen vagy enyhén színes észtereket használnak, amelyek enzimes hasítással valamilyen színtelen savra és egy ugyancsak színeden alkohol-(fenol-) komponensre esnek szét. Utóbbit azután az enzimes hidrolízist követő reakcióban színes termékké reagáltatják, például diazóniumsókkal kapcsolva vagy oxidációs reakcióban. F. Schmalzl és H. Braunsteiner leírnak például a Kiin. Wschr. 46, 642 (1968)-ban egy specifikus citokémiai leukocita-észteráz kimutatást Naftol-AS-D(klór-acetáttal), mint szubsztráttal és a színes azovegyület képzésére szolgáló valamilyen diazóniumsóval. Leukociták testfolyadékokban, például vizeletben való gyors és egyszerű kimutatására szolgáló készítményként az ilyenfajta kétkomponensű rendszerek alkalmatlannak bizonyultak. Például 5000 leukocita/pl-es minták semmilyen reakciót nem mutatnak. Ezenkívül ismeretes, hogy vizeletben előforduló számos vegyület, például urobilinogén, stercobilinogén, bilirubin és mások diazóniumsókkal reagálnak. Ezt legjobban a kereskedelemben kapható, urobilinogén vagy bilirubin vizeletben való kimutatására szolgáló, szabadalmazott tesztek bizonyítják, amelyek a kimutatási reakcióhoz diazóniumsókat használnak. Az irodalomban az észter íz-kimutatásra használt diazóniumsók a leírt mellekreakciót adják a vizelet más alkotórészeivel, és részben saját színük miatt sem használhatók leukocita-teszthez. A jelen találmány feladata ezért az volt, hogy c lyan készítményt biztosítson észteráz és/vagy proteáz enzimek kimutatására észterek és diazóniumsók kombinációjával reakciópartnerként ezen enzimek részére, amellyel ezek egyszerű és könnyen kezelhető módon rövidebb idő alatt kimutathatók, és amelyek a vizsgált minta más alkotórészeivel semmilyen reakciót nem adnak. Ezt a feladatot úgy oldottuk meg, hogy alkalmas észterek és speciálisan szubsztituált diazóniumsók bizonyos kombinációját alkalmazzuk, ahol meglepő módon az alkalmazott diazóniumsók a vizelet más alkotórészeivel, például bilirubinnal és urobilirogénnel semmilyen mellékreakcióba nem lépnek, f anem az alkalmazott észter hasításánál keletkező fenolos komponenssel specifikusan és gyorsan színes vegyület keletkezése közben kapcsolódnak. Az alkalmazott észtereknek az észteráz és/vagy proteáz enzimekkel szemben eléggé reaktívaknak kell lenniük, hogy a lehető leggyorsabban hasadjanak, a sav- és alkohol-komponensre (amelyeken fenolokat is értünk). Az észtereket abból a szempontból is jól kell megválasztani, hogy a szabaddá váló alkohol-komponensek jól és teljesen kapcsolódjanak az alkalmazott diazóniumsókkal. A diazóniumsók reaktivitását a szubsztituensek alkalmas megválasztásával oly módon kell összehangolni, hogy bár a találmány szerint alkalmazott észterekből szabaddá váló alkohol-komponensekkel kielégítően gyors kapcsolás menjen végbe, a tesztoldat egyéb alkotórészeivel azonban semmilyen reakció ne menjen végbe. A jelen találmány tárgya tehát készítmény, különösen leukocitákban lévő észteráz és/vagy proteáz enzimek kimutatására, amely az említett enzimek meghatározására szolgáló kimutató-reagenst, puffért és adott esetben további adalékanyagot tartalmaz és szivóképes hordozóból, filmrétegből, porkeverékből, liofilizátumból, oldatból vagy reagens"ablettából áll; a találmány szerinti készítményt az jellemzi, hogy az említett enzimek kimutatóeagenseként valamely I általános képletű szubsztimált diazóniumsóból - a képletben R! jelentése 1-3 szénatomos alkil-, 1-3 szénatonos alkoxi- vagy morfolino-csoport, halogén- vagy hidrogénatom, R2 jelentése hidrogénatom vagy 1-3 szénatomos alkoxiesoport, R3 jelentése 1-3 szénatomos alkoxi-, fenoxi-, 1-3 szénatomos alkil-tio-, di-(l-3 szénatomos aIkiI)-amino-, hidroxi-, morfolino-, tiomorfolino-, 1-pirrolidinil; adott esetben 1-3 szénatomos alkilcsoporttal 4-helyzetben alkilezett piperazinil-, piperidino-, fenil-amino- vagy adott esetben 4-helyzetben 1-3 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált fenil-csoport, halogénvagy hidrogénatom, R4 és R5 jelentése azonos vagy eltérő és 1-3 szénatomos alkoxiesoportot vagy hidrogénatomot képvisel, R, és R2 adott esetben együtt egy —CH=CH—CH=CH—csoportot jelent és X jelentése tetrafluoro-borát- vagy tetra-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
