187324. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hidroxi-alkil-purinok észter-származékainak előállítására
1 187 324 2 10. táblázat NPT 15 392 képződése az acetoxi-noníl-hipoxantin (NPT 15 458) és a szukciniloxi-nonil-hipoxantin (NPT 15 457) egereknek történő i. p. beadását követően Beadóit Ál- Vét szint [mikromól/ml x 10’] vegyüld* lat # NPT 15 392 NPT 15 457 NPT 15 458 NPT 15 392 1 0,22-_ 2 0.68-NPT 15 457 1 0,47 1,4-2 0,22 0,57-NPT 15 458 1 8.2-0 2 2.7-0 s 360 mikrontól, kg. Az eritro-9-( 2-aceloxi-3-nonil)-hipoxar,tin hatása a tumor (leukémia) sejtek növekedésére in vivo kísér-Jetben A növekedés százalékos gátlása V egy ti lel Koncentráció L 1210 8068 (egér) (humán) NPT 15 458 1( > mikrogramm ml 40 32 II. táblázat A biológiai tulajdonságok összefoglalása 1 III.: J. NPT 15 457 NPT 15 458 NPT 15 392 A/ NPT 15 392 vei \aló kon ver lihihiás Kémiai pH ---9.5 igen igen nem értelmezhető pl i 7.0 Bioiéig iái nem nem nem értelmezhető 11 piti 18 100 nem értelmezhető Máj 14 70 nem értelmezhető Verő 0 50 nem értelmezhető l.gér 25 100 nem érielme/hető Bioféíjitii hahK Vírusölő (in vitro) igen gyenge igen (88%) igen (73%) Immunomoduláló (in vitro) igen igen igen Lymph, prolit. (+14-28%) ( + 43-48%) (+12-27%) [mmunomoduláló (ín vitro) igen Rözet la Immunomodulaló (+166%) igen (11%) igen (+ 78%) (in vivo) mérsékelt igen SRBC-lgM (0-60%) (-72%) igen (+ 46%) A fenti tulajdonságok meghatározása céljából az alábbi eljárásokat alkalmaztuk. A) Sejttenyésztési eljárások a) Hela vagy Verő sejt tenyésztése 1. A sejteket egyrétegű előtenyészetben tenyésztettük 120 arr-es lombikokban az alábbi módon: 2. A tenyészközeget leöntöttük, majd az egyréteget kétszer kb. 50 ml magnézium- és kalciummenles, foszfáttal puliéról! sóoldaltal (PBS) mostuk 7,2-es pH-értéken. 3. Mindegyik lombikhoz 37 °C-on hozzáadtunk egy-egy ml tripszin-EDTA oldatot - amely a kalcium- és magnéziumionmentes Hanks-féle kiegyenlített sóoldat (HBSS) I literjére számítva 0,5 g tripszint (1 : 250) és 2,0 g EDTA-t tartalmazott , majd enyhe rázással diszpergáltuk az egyréteg felett. 4. Ezt követően a lombikokat körülbelül 3 5 percre egy 37 °C-os inkubátorba helyeztük. Az inkubálás időtartamát a sejtek elmozdításához szükséges idő határozta meg. Kézzel végzett rázás szükséges. 5. Mindegyik lombikhoz hozzáadtunk 10 ml tenyészközeget, -amelyet felszívatással és a szuszpenziónak a pipettából való kiengedésével diszpergáltunk. Ezt tíz alkalommal hajtottuk végre. 6. A lombikok tartalmát összegyűjtöttük, és a s/uszpenzióban lévő sejteket a tenyészközeggel 7 8,5 x 1()4 sejt ml értékre hígítottuk fel. 7. A tenyészközeg összetétele a következő volt: Minimum Essentia! Medium Eagles (MEM) Earl's sókkal és HEPES púderral, melyet úgy- egészítettünk ki, hogy 100 ml MEM-re vonatkoztatva a következő anyagokat adtuk hozzá: 10 ml magzati borjú szérum (PC'S) (végső koncentráció: 10”,,); 1 ml 1-glulamin (200 mólos): és 1 ml 10 000 egység penicillin, 10 000 mikrogrumm streptomycin és 10 000 mikrogramm neomycin keverékéből. 8. A sejteket Costar szövettenyészel tálcákon előtenyésztettiik, amelyek 24. egyenként 3 mi-es térfogatú, lapos fenekű lyukból álltak; 9. Az egyrétegűket kísérletezésre használtuk fel, amikor is azok szinte egybefolyó növekedést értek el (körülbelül I 2 nap). 10. A .sejtvonalak fenntartására különálló lombikokat használtunk. A közeg karbantartása abban állt. hogy 5"„ magzati borjú szérum tartalmúra csökkentett további MÉM közeget (lásd 7. lépés) adtunk hozzá. B) Vörös vériestek 1. A vér teljes mennyiségét szívpungálással nyertük hím, Hartly törzsbe tartozó tengerimalacokból. 2. Körülbelül 10 cm3 vért összekevertünk 25 ml Alsever’s oldattal; ez a keverék 4 °C-on egy hétig terjedő ideig tárolható. 3. Közvetlenül felhasználás előtt a vörös vértesieket (RBC) három ízben mostuk 7,2-es pH-jú foszfáttal pufferolt sóoldaltal (PBS). 4. Mindegyik mosást úgy végeztük el, hogy az RBC-szuszpenziót 10 percig centrifugáltuk 450 g értéken szobahőmérsékleten. 5. Egy 0,4 térfogatszázalékos RBC-szuszpenziót készítettünk Hanks-féle kiegyenlített sóoldattal. C) Vírusok tojás-tenyésztése a) Injekció 1.9~ 10 napos megtermékenyített csirketojásokat életképességük felderítése végett meglámpáz.tunk, majd a héjukon ceruzával bejelöltük légzsákjaik helyét. Azokat a tojásokat, amelyek életképessége kérdéses volt (mozgás hiánya vagy elszíneződés), kidobtuk. 5 iO 5 20 25 30 35 40 4E 50 55 60 65 8
