187324. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hidroxi-alkil-purinok észter-származékainak előállítására
1 187 324 2 2. A tojások héját 70%-os etanollal fertőtlenítettük, majd hagytuk megszáradni. 3. Egy steril pontozóval körülbelül 0,6 cm-es lyukakat vágtunk a tojások héján a légzsákok ceruzával jelzett helyén. 4. Egy 1 cm3-es Tuberculin fecskendővel 45°-os szögben különböző vírus-szuszpenziókat (102—103 EID/ml) juttattunk be a lyukakon át az üregekbe 0,1 ml-es mennyiségben. Gondot fordítottunk arra, hogy az embrió vagy a petehártya ne sérüljön meg. 5. A lyukakat körülbelül 2,5 cm-es műanyag szalaggal lezártuk, mindegyik tojáson feltüntettük a megfelelő vírust, a tojás számát és a dátumot. 6. A vírusnövekedés sebességétől függően a tojásokat 2-5 napon át inkubáltuk 35-37 ”C-on. Minden esetben feljegyeztük az időt, a hőmérsékletet és az egyéb vonatkozó adatokat. b) Az embrionális folyadékok összegyűjtése 1. Az inkubálási időszak végén az embrionális üreg bevérzése veszélyének csökkentése végett a tojásokat 3-4 órára - a vírusok összegyűjtésének idejére - 4 °C-ra hűtöttük le. 2. A tojáshéjakat ismét 70%-os etanollal fertőtlenítettük, majd hagytuk megszáradni. 3.Steril ollókkal a ceruzával jelzett vonal mentén levágtuk a tojások tetejét, majd steril csipeszekkel letéptük a membránokat. 4. A csipeszeket lágyan behelyeztük az embrió és a tojás membrán közé, és az embriót az egyik oldalra toltuk. így az embrionális folyadék egy „zsebet” alkotott. Gondosan jártunk el, nehogy átlyukaszszuk a magzatburkot (kivéve azokat az eseteket, mikor a magzatburki folyadékot is összegyűjtöttük), továbbá hogy csökkensük a méhlepényartériák elszakadásának veszélyét. 5. Vákuumos ampullával ellátott, steril, egyszer felhasználható 10 ml-es pipettákat használtunk az embrionális folyadék összegyűjtésére, valamint azok továbbítására az egyszer felhasználható, steril centrifugacsövekbe. Mindegyik tojásból körülbelül 5-8 ml folyadék gyűjthető össze. 6. Az összegyűjtött anyagot 1200 g mellett centrifugáltuk 10 percen át 4 °C-on. A szupernatáns folyadékokat steril kémcsövekbe helyeztük. 7. Mindegyik összegyűjtött anyagból mintákat vettünk titrálás és sterilitás-vizsgálat céljára. A visszamaradó szuszpenziót 2 cm3-es kémcsövekbe szétosztottuk, melyeken megjelöltük a törzs nevét. a sorszámát és a dátumot. 8. Az alikvot részeket folyadék halmazállapotú nitrogénben azonnal megfagyasztottuk, -70 °C-on ultrafagyasztóban vagy folyékony nitrogén kriohűtőben elraktároztuk. D) Virustenyésztés szövettenyészetben a) Infekció 1. A megfelelő sejttípus 24-48 órás egyrétegű tenyésztése; általában 250 cm2-es egyszeri felhasználású szövettenyészet-edényeket választottunk erre a célra, ha a tenyészet alig volt egybefolyó. 2. Az infekciót és az összegyűjtést biológiai biztonsági üvegszekrényben végeztük, és kizárólag mechanikus pipettákat használtunk. Gondoskodtunk a steril eljárásról. 3. Az infekció előtti tenyészetekben a tenyészközeg helyettesítésére 25 ml karbantartási közeget használtunk. A kontroll tenyészetekhez szintén 25 ml karbantartási közeget adtunk. 4 A vírusforrást a beszerzési forrásból származó infcrmáció vagy az előző lépések titrálásainak eredményei szerint szérummentes MEM-mel hígítottuk, és a kontrollok kivételével mindegyik tenyészethez 0,5 ml-t adtunk. 5. A tenyészeteket 37 °C-on inkubáltuk 5% C02- ot és 95% levegőt tartalmazó nedves atmoszférában 48-72 óra hosszat. Az egyes vírusokra jellemző citcpata hatások (CPE) kifejlődését naponta megfigyeltük. t) Begyűjtés 1. Amint a CPE elérte a 3 + és 4+ közötti értéket, a tenyészeteket összegyűjtés céljából eltávolítod uk. C - Nincs látható citopata hatás. 1 + -A sejtek 25%-án látszik citopata hatás. 2 + - A sejtek 50%-án látszik citopata hatás. ? + - A sejtek 75%-án látszik citopata hatás. 4 + - A sejtek 100%-án látszik citopata hatás. 2. Lízis és a sejtréteg kimozdítása céljából a tenyészeteket háromszor megfagyasztottuk és felengedtettük. A harmadik felengedtetés után a tenyeszfolyadékot átvittük egy steril, egyszer felhasználható centrifugacsőbe, majd 30 percig centrifugáltuk 300 g mellett a sejttörmelékek eltávolítása végett. Megvizsgáltuk a vírus-szuszpenzió bakteriális fertőzöttségét. 3. A szupernatáns folyadékokat azonnal részekre osztottuk (0,5-1 ml) 2 cm3-es steril szérumcsöbe, m; jd folyékony nitrogénben megfagyasztottuk. 4. Titrálás céljára egyrétegű tenyészeteket állítottunk elő 24 lyukú, lapos fenekű szövettenyészetlapokon, majd az alábbi módon inficiáltuk. i)Elkészítettük a vírus 10-szeres hígitási sorozatát hideg, 5%-os magzati borjúszérum (FCS) karbantartási közegben (10_—10 7). b) Mindegyik hígításból 1 ml-nyit adtunk egyegy lyukba, és ezt háromszor ismételtük. S) A kontroll tenyészetek csak karbantartási közeget tartalmaztak. 5. A tenyészeteket 24 órán át inkubáltuk 37 °C- or 5% C02-ot és 95% levegőt tartalmazó nedves atmoszférában, és a sejtrétegeket a már ismertetett skála segítségével értékeltük ki. A TC1D50 értékeket a titrálás Reed és Munch-féle módszerével szám tottuk ki. El Hemadszorpciós vizsgálat (HAd) 1. Közvetlenül a hemadszorpciós vizsgálat elvégzése előtt a közeget dekantáltuk a sejttenyészet tálcákról. 2. Mindegyik tenyészet-lyukhoz 1 ml karbantartási közeget adtunk. 3. Két sorozat kontroll tenyészethez csak karbantartási közeget adtunk. 4. A vizsgálati tenyészeteket, valamint a kontroll sorozatok egyikét azonnal beoltottuk 0,1 ml hígított víruskészítménnyel. (Az input keverési arányokat a megelőző HAdFFU vizsgálatok szerint határoztuk meg.) A HAdFFU jelentése: hemadszorpcióf gócképződési egység. 5. A többi kontroll sorozatot nem fertőztük be 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
