187258. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vérnyomáscsökkentő hatású vegyületek előállítására
5 187258 6 ACE-gátló vegyületek különböző helyein lévő prolin helyére. A fenti I általános képletben a kénatomtól balra eső arainosav szerepét eddig még nem tisztáztuk. Feltételezzük, hogy ez az aminosav az enzim számára egy további felismerési hely. Ha ez a feltételezés igaz, akkor azt várhatjuk, hogy az ezen a helyen aminosav-részt tartalmazó vegyületek erősebb ACE-gátlók lesznek. Nem volt ismeretes, hogy melyik aminosav volna szükséges ezen a helyen a hatáshoz, és hogy valóban aminosav szükséges-e, továbbá, hogy melyik aminosav tudná egy adott vegyület gátló hatását erősebbé tenni, és hogy erre a célra aminosav szükséges-e. Azt találtuk, hogy különböző aminosavak beépítése hatékony vegyületeket eredményezett, és hogy a hidroxi-proünok, a prolin, L- és D,L-3,4-dehidro-prolin és tiazolidin-származékok egyaránt hatékony vérnyomáscsökkentő szerek, és mind erősen gátolják az angiotenzint átalakitó enzimet. A találmány szerinti eljárást a továbbiakban, a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül, példákkal szemléltetjük. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatokhoz szilikagél lemezeket használtunk. A futtatáshoz használt oldószer-elegyek száma és összetétele (térfogatrészben kifejezve e) a következő: 1. metanol-kloroform = 1 : 1 2. benzol-vi z-ecetsav = 9:1:1 3. ecetsav-viz-n-butanol = 26 : 24 : 150 4. n-butanol-piridin-ecetsav-viz = 15 : 10 : 3 : 12 5. kloroform-metanol-ammónium-hidroxid = 60 : 45 : 20 6. n- butanol-ecetsav-etilacetát-víz = 1 : 1 : 1 : 1 7. kloroform-metanol-ecetsav = 2 : 1 : 0,003 8. n- butanol-ecetsav-viz = 4:1:1 A papir-elektroforézishez használt puffér-oldatok:PH 1,9 : hangyasav--ecetsav-viz = 3 : 2 : 25 PH 5,0 : dietilén-glikol-ecetsav-piridin-víz = 100 : 6 : 8,5 : : 885. Az aminosavak tercier-butoxi-karbonil-, benzoil-, acetil-, formil-, propionil-, butiril-, fenil-acetil- és fenil-propionil-származékai a kereskedelemben kapható vegyületek. A Sephadex LH-20, Sephadex G-10 és a Sephadex G-25 a Pharmacia, Inc. cég (Uppsala, Svédország) védjegyzett termékei. 1. példa Az ACE (angiotenzint átalakító enzim) aktivitásának meghatározása Az itt leirt kísérletek többségében az enzim-aktivitást 8,0-as pH-jú, 0,1 mól nátrium-kloridot és 0,75 mól nátrium-szulfátot is tartalmazó, 0,05 mólos Hepes-puffer-oldatban határozzuk meg. Szubsztrátként benzoil-Gly-Hys-Leu-t (végkoncentráció: 1,10"4 mól; Ka = 2 x 104 mól) és körülbelül 130,000 cpm aktivitású 3H-benzoil-Gly-Hys-Leu-t (25 Curie/millimól) használunk. Az enzimet a fenti puffer-oldattal olyan mértékben hígítjuk, hogy 40 pl, pufferral hígított enzim 15 perces, 37 °C-on végzett inkubáció alatt a szubsztrát 13%-át tudja elhidrolizálni. A mérés beindítása céljából 40 pl enzimet és 10 pl vizet, vagy vízben feloldott inhibitort 37 °C hőmérsékleten 5 percig elöinkubálunk. Utána 50 pl szubsztrát hozzáadásával beindítjuk a reakciót, majd az oldatot 37 °C hőmérsékleten 15 percig inkubéljuk. A reakció leállítása céljából az oldathoz hozzáadunk 1 ml 0,1 mólos sósav-oldatot, majd utána 1 ml etil-acetátot. Az elegyet összekeverjük, majd rövid ideig végzett centrifugálással szétválasztjuk a fázisokat. Az etil-acetátos fázis 500 pl-nyi részletét folyadék-szcintillációs fiolába tesszük, amely 10 ml Riafluor-t (New England Nuclear Corporation, Boston, Massachusetts) tartalmaz. Az I»-(50%-os gátlás)-értékek meghatározása céljából a gátló anyag különböző koncentrációi mellett mért enzim-aktivitás értékeket összehasonlítjuk a gátló anyag nélkül mért enzim-aktivitás értékkel. A százalékos gátlást a gátló anyag koncentrációjának függvényében grafikusan ábrázoljuk, és erről leolvassuk az Iso-értéket. 2. példa N-(3-Acetilmerkapto-propionil)-L-prolin-tercier-butil-észter 0,865 g 3-acetilmerkapto-propionsavat feloldunk 2 ml kétszer desztillált tetrahidro-furánban, és az oldathoz 0 °C hőmérsékleten hozzáadjuk 1,2031 g N,N’-diciklohexil-karbodiimid 2 ml tetrahidro-furánnal készült lehűtött oldatát, majd 1 g prolin-tercier-butil-észter lehűtött oldatát. A reakcióelegyet 1 órán át 0 °C, majd éjszakán ét 4 °C hőmérsékleten keverjük. Utána a kivált csapadékot kiszűrjük, és etil-acetáttal kimossuk. A szűrletröl az oldószereket csökkentett nyomáson, rotavaporon (forgó rendszerű desztilláló készüléken) ledesztilláljuk. A maradékot feloldjuk etil-acetátban, és az etil-acetátos oldatot normál hideg citromsav-oldattal háromszor, utána telített nátriura-klorid oldattal kétszer, ezután normál hideg nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal kétszer, és végül telített nátrium-klorid oldattal háromszor mossuk. Utána vízmentes magnézium-szulfáton megszáritjuk, és az oldószert 30 °C hőmérsékleten csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Ily módon c 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
