187152. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklodextrin glikoziltranszferáz enzim immobilizálására
1 ..187 152 2 A találmány szerinti eljárással előállított, immobilizált enzimkészitmények aktivitása 13-450 Kitahata egység/g xerogél, ami a gyakorlati felhasználás szempontjából igen kedvezőnek tekinthető. [Egy egység az az enzimmennyiség, amely 1 % lineáris transzmisszió növekedést eredményez percenként, 40°C-on; lásd Agr. Biol. Chem. 38, 387 (1974)]. Az eljárásunkkal akrilamid-N,N'-metilén-biszakrilamid-akrilsav kopolimeren (Akrilex C) immobilizált CGTáz enyhén savas közegben, tehát alkalmazásának optimális pH-ján (pH = 5,5) nagyobb stabilitást mutat, mint az oldható enzim. Ez jelentős előny a tartós használat szempontjából. A találmány szerinti eljárásokat az oltalmi kör korlátozása nélkül, az alábbi példákon részletesen ismertetjük. 1. példa 3 g Cellulóz A típusú hordozóhoz, amelynek szárazanyagtartalma 17%, kötőkapacitása (NH2- tartalma) 1,86 mekv/g volt, 55 ml sómentesített CGTáz oldatot adtunk, amelynek fehérjetartalma 9,9 mg/ml volt. Az enzim oldásához és dialíziséhez 0,05 mólos nátrium-acetát puffert (pH = 6,5) használtunk. 10 perc jeges vízfürdőn történő kevertetés után, 20 ml hideg ( + 4 °C) pufferben oldott, 1 g N-ciklohexil-N'-[2-(4-morfolinil)-etil]-karbodi-imid-metil-p-toluol-szulfonátot adtunk hozzá. A reakcióidő - 0-4 °C-on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órán keresztül kevertettük a reakcióelegyet. Ezután a szilárd fázist szűréssel elválasztottuk és háromszor 60 ml nátrium-acetát pufferrel (pH = 6,5), háromszor 60 ml - 1 mól nátriumkloridot tartalmazó - 0,05 mólos nátrium-acetát pufferrel (pH = 6,5), majd háromszor 60 ml 0,05 mólos nátriumacetát pufferrel (pH = 6,5) mostuk. Végül az anyagot háromszor 120 ml desztillált vízzel sómentesre mostuk. Szűrés után az anyagot 40 ml 0,05 mólos nátrium-acetát pufferben (pH = 6,5) vettük fel és hűtőszekrényben ( + 4°C) tároltuk. Kitermelés: 758 mg (szárazanyagra vonatkoztatva) immobiíizált CGTáz. Aktivitás: 26,5 Kitahata egység/g szárazanyag. 2. példa 1,5 g Molselect A típusú hordozóhoz, amelynek szárazanyagtartalma 33%, kötőkapacitása (—NHrtartalma) 1,27 mekv/g volt, 55 ml sómentesített CGTáz oldatot adtunk, amelynek fehérjetartalma 9,9 mg/ml volt. Az enzim oldásához és dializiséhez 0,05 mólos nátrium-acetát puffert (pH = 6,5) használtunk. 10 perc, jeges vízfürdőben történő kevertetés után, a szuszpenzióhoz 0,5 g N- ciklohexil-N'-[2-(4-morfolinil)-etil]-karbodi-imid-metíl-p-toluol-szulfonátot adtunk, amelyet előzőleg 5 ml hideg ( + 4 °C) 0,05 mólos nátriumacetát pufferben (pH = 6,5) oldottunk. A reakcióidő - 0-4 °C-on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órán át kevertettük a szuszpenziót. Ezután a gélt szűréssel eltávolítottuk és háromszor 60 ml 0,05 mólos nátrium-acetát pufferrel (pH = 6,5), háromszor 60 ml - 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó - 0,05 mólos nátrium-acetát pufferrel (pH = 6,5), majd háromszor 60 ml 0,05 mólos nátrium-acetát pufferrel (pH = 6,5) mostuk. Végül a gélt kétszer 120 ml desztillált vízzel sómentesre mostuk. Szűrés után az anyagot 40 ml 0,05 mólos nátrium-acetát pufferben (pH = 6,5) vettük fel és hűtőszekrényben ( + 4°C) tároltuk. Kitermelés 861 mg (szárazanyagra vonatkoztatva) immobiíizált CGTáz. Aktivitás: 13,6 Kitahata egység/g szárazanyag. 3. példa 0,4 g Akrilex AH-C4 xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—COOH-tartalma) 3,08 mekv/g volt, 8 ml 0,05 mólos nátrium-acetát pufferben (pH = 6,5) szuszpendáltunk, majd jeges vízfürdőn állandó kevertetés közben - hozzáadtunk 0,08 g N- ciklohexil-N'-[2-(4-morfolinil)-etil]-karbodi-imid-metil-p-toluol-szulfonátot, amelyet előzőleg 10 ml hideg ( + 4 °C) pufiferben oldottunk. 10 perc kevertetés után, a reakcióelegyhez 40 ml CGTáz oldatot (10 mg/ml) adtunk. Az enzim oldásánál és dialízisénél 0,05 mólos nátrium-acetát puffert (pH = 6,5) használtunk. A teljes reakcióidő -0-4 °C-on - 48 óra volt, amiből kétszer 6 órát kevertettünk. Ezután a gélt szűréssel elválasztottuk és háromszor 50 ml 0,05 mólos nátrium-acetát pufferrel (pH = 6,5), háromszor 100 ml - 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó - 0,05 mólos nátriumacetát pufferrel (pH = 6,5), majd kétszer 100 ml 0,05 mólos nátrium-acetát pufferrel mostuk. Végül a gélt kétszer 250 ml desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 0,2 g immobilizált CGTáz. Aktivitás: 80 Kitahata egység/g xerogél. 4. példa 0,13 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—COOH-tartalma) 6,2 mekv/g, szemcsenagysága 100-320 pm volt, 5 ml 0,05 mólos nátrium-acetát pufiferben (pH = 5,0) szuszpendáltunk, majd 0 °C-on - állandó kevertetés közben - hozzáadtunk 0,25 g N-ciklohexil-N'-[2-(4-morfolinil)etil]-karbodiimid-metil-p-toluol-szulfonátot, amelyet előzőleg 5 ml hideg ( + 4 °C) 0,05 mólos nátrium-acetát pufiferben (pH = 5,0) oldottunk fel. 10 perc további kevertetés után, a reakcióelegyhez 11 ml CGTáz oldatot (11,4 mg/ml) adtunk, majd a reakcióelegy pH-ját 5,0-re állítottuk. A teljes reakcióidő - 0--4 °C-on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órát kevertettük a szuszpenziót. A reakció kezdetén félóránként, később óránként ellenőriztük a pH-t, és szükség esetén korrigáltuk. A reakció befejeződése után a gélt centrifugálással elválasztottuk és háromszor 30 ml 0,05 mólos nátrium-acetát pufferrel (pH = 5,0), háromszor 30 ml - 1 mól nátriumkloridot tartalmazó - 0,05 mólos nátrium-acetát pufferrel (pH = 5,0), majd háromszor 30 ml nátrium-acetát pufferrel (pH = 5,0) mostuk. Végül a gélt háromszor 60 ml desztillált vízzel sómentesre i . 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
