187152. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklodextrin glikoziltranszferáz enzim immobilizálására
1 i 187 152 2 A találmány ciklodextrin glikoziltranszferáz enzim immobilizálására vonatkozik. A részlegesen hidrolizált keményítő ciklodextrin glikoziltranszferáz enzimmel (továbbiakban CGTáz) történő kezelése során 6, 7, illetve 8 glukopiranóz egységből felépülő molekulagyűrűk, ún. ciklodextrinek (a-, ß- és y-ciklodextrin) • keletkeznek, amelyeknek jellemző tulajdonsága, hogy más vegyületek molekuláit képesek magukba zárni. A jelenség, amelyet „molekuláris kapszulázás”-nak neveznek, felhasználható egyes érzékeny, illékony, könnyen oxidálódó vagy rosszul oldódó anyagok tulajdonságainak javítására. Oldott CGTáz enzim alkalmazásával csak szakaszos eljárás valósítható meg. Folyamatos eljárásokhoz az enzimet célszerű szilárd fázisú hordozón immobilizálni. Ilyen eljárást ismertet a Biotechnoi. Bioeng. 19, 87 (1977) közlemény, amely szerint a CGTáz szukcinált formája egy vinilpiridin kopolimer anioncserélőn, ionos kötéseken keresztül immobilizálható. Ebben az esetben, bár az előzetes szukcinálás fokozza az ionos kötések erősségét, mégis számítani kell az enzim fokozatos deszorpciójára. A deszorpció elkerülhető, ha az enzimet kovalens kötéseken keresztül kapcsoljuk a hordozóhoz, mivel ebben az esetben egy új, az enzim katalitikus aktivitását megőrző, szilárd fázisú katalizátor keletkezik, amely a reakciókörülményekre kevésbé érzékeny. A találmány célja tehát, szilárd fázisú hordozón kovalens kötéseken keresztül immobilizált CGTáz enzim előállítása. A találmány értelmében olyan immobilizált CGTáz enzimkészítményt kívánunk előállítani, amely tartós felhasználásra alkalmas és az enzimet kémiailag viszonylag ellenálló vagy inert, mikroorganizmusoknak részben vagy korlátlanul ellenálló," jó mechanikai tulajdonságokkal rendelkező, nagy átfolyási sebességet biztosító hordozóhoz kötött állapotban tartalmazza. További követelmény, hogy az enzim enyhe reakciókörülmények között legyen a hordozóhoz kapcsolható. Vizsgálataink alapján, poliszacharidok primer aminocsoporttal rendelkező származékai, amelyek legalábbO,l mekv/g,célszerűen l-2mekv/g—NH2 funkciós csoportot tartalmaznak, továbbá az akrilsav és/vagy metakrilsav, valamint akrilamid és/ vagy metakrilamid monomerekből akril- vagy alliltípusú térhálósítószerrel (így N,N'-metilén-biszakrilamiddal, etilén-diakriláttal vagy N,N'-diallilborkősavamiddal) felépített, legalább 0,1 mekv/g, célszerűen 2-8 mekv/g —COOH funkciós csoportot tartalmazó polimerek teljes mértékben kielégítik a hordozókkal szemben támasztott követelményeket. Ezeket a hordozókat önmagukban ismert módszerekkel állíthatjuk elő. Primer, aminocsoportokat tartalmazó poliszacharid hordozók esetén, az enzim egyes aszpartilvagy glutamil-oldalláncainak karboxilcsoportjait karbodiimides kezeléssel O-acil-izokarbamid származékká alakítjuk át és ez lép reakcióba a hordozón elhelyezkedő aminocsoportokkal. Karboxilfunkciós csoportokkal rendelkező polimer hordozók alkalmazásánál a karboxilcsoportokat az önmagában ismert karbodiimides aktiválással aktiváljuk és így alkalmassá válnak a CGTáz enzim megkötésére. A karbodiimidek aktiválószerként való használata azért előnyös, mert az aktiválási reakció enyhe körülmények (0-4 °C ; pH = 6,0-8,0) között is végrehajtható. A találmány tárgya tehát eljárás immobilizált CGTáz enzimkészítmény előállítására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy (1) a CGTáz enzimet vízben oldható, vagy 0 °C alatti hőmérsékleteken szerves oldószerekben oldható karbodiimid vegyülettel kezeljük és az így kezelt enzimet 4,5 és 8,5 közötti pH-értékű oldatban poliszacharidok legalább 0,1 mekv/g —hírcsoporttal rendelkező származékaira visszük fel, vagy (2) az akrilsav és/vagy metakrilsav, valamint akrilamid és/vagy metakrilamid részegységekből akrilvagy allil-típusú térhálósítószerrel felépített, legalább 0,1 mekv/g—COOH funkciós csoportot tartalmazó polimert vízben oldható, vagy 0 °C alatti hőmérsékleten szerves oldószerben oldható karbodiimid vegyülettel kezelünk, az így aktivált hordozóra 4,5 és 8,5 közötti pH-értékű oldatban CGTáz enzimet viszünk fel. Mindkét esetben a kapott terméket mossuk, végül kívánt esetben szárítjuk. A találmány szerinti eljárásban különösen előnyösen használhatjuk fel a következő polimereket : Cellulóz A (cellulóz primer amino funkciós csoportokat hordozó éter-származéka, gyártja a Reanal Finomvegyszergyár), Molselect A (dextrán primer amino funkciós csoportokat hordozó éter-származéka, gyártja a Reanal Finomvegyszergyár), Akrilex AH-C4 (akrilamid - akrilsav-hidrazidhidroklorid - N,N'-metilén-bisz-akrilamid kopolimer szukcinilezett származéka, karboxil funkciós csoportokkal, gyártja a Reanal Finomvegyszergyár), és Akrilex C-100 (akrilamid - akrilsav - N,N'metilén-bisz-akrilamid kopolimer karboxil funkciós csoportokkal, gyártja a Reanal Finomvegyszergyár). A találmány szerinti eljárásban enzimként tetszés szerinti eredetű, bármilyen ismert módon elkülönített CGTáz-t felhasználhatunk. Aktiváló karbodiimid vegyületként például N-ciklohexil-N'-(2-[4-morfolinil]-etil)-kardociimid-metil-p-toluol-szulfátot vagy N-etil-N'-(3- [dimetil-amino]-propil)-karbodiimid-hidrokloridot használhatunk fel. Karbodiimid vegyületek ként előnyösen vízben oldható anyagokat alkalmazunk. A csak szerves oldószerben oldható karbodiimid vegyületek közül a találmány szerinti eljárásban csak azok használhatók fel, amelyek az adott szerves oldószerben hidegen (azaz 0 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten) is megfelelően oldódnak. A hordozókra 4,5 és 8,5 közötti pH-értékű - előnyösen pH = 6,5-ös - oldatból visszük fel a CGTáz-t, illetve O-acilizourea származékát. A reakció közegéül célszerűen 0,05-0,1 mólos nátriumacetát pufferoldat szolgál, amelynek pH-ja 6,5. A kapcsolási reakcióval kialakított immobilizált enzimkészítményeket ismert módon mossuk, majd kívánt esetben szárítjuk. Az enzimkészítményeket azonban - 0-4 °C-on - vizes szuszpenzióban is eltarthatjuk. I 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
