186976. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nem-enzimatikus úton glikozilálódott fehérjék glükóztartalmának meghatározására és az eljárás kivitelezésére szolgáló reagens-kittek
2 186976 3 A találmány tárgya nem-enzimatikns úton glikozílálódott feliérjék spektrofotometriás meghatározására és a meghatározáshoz, használható vegyszerkészletre (KIT) vonatkozik. A fehérjék az őket körülvevő közeg glukóztartalmától függően több-kevesebb glukózt kötnek meg aspecifikusan, reaktív csoportjaikon (elsősorban az X-terminál is aminocsoporton és a lizil-oldalláneok e-aminocsoportjain) keresztül. Ez az in vivő és in vitro is lejátszódó folyamat azért nagy jelentőségű, mert a glikozilált fehérjék egyes tulajdonságai (pl. funkcionális aktivitás, immunológiai jellemzők és stabilitás) megváltozhatnak. Az in vivo folyamat jelentőségét elsősorban a diabetes mellitusban létrejövő, fokozott nem-enzimatikus glikozilálódás adja, amely lényeges szerepet játszik a betegség késői szövődményeinek kialakulásában. Az in vitro folyamat követése a különböző fehérjék, elsősorban a biológiai eredetű folyadékok (vér, tej stb.) tárolása és újrafelhasználása szempontjából lényeges. A diabetes mellitusban szenvedő betegek kezelésében és krónikus szövődményeinek megelőzésében alapvető fontosságú a szénhidrát-anyagcsere beállítottsági fokának ellenőrzése. Az aktuális vércukorszint-mérést ugyanis a napi szénhidrátfogyasztás erősen befolyásolja, így a szervezet szénhidrát-anyagcseréjéről nem ad megbízható felvilágosítást. Nem szolgáltat adatokat továbbá a vizsgálatot megelőző időszak helyzetéről sem. A megfelelő ellenőrzés módszereként néhány éve már az egy meghatározott helyen (ß-lanc N-terminálisán) glikozilált hemoglobin, a hemoglobin AIe (továbbiakban Hb AIC) vagy az ún. gyors hemoglobin komponensek mennyiségének meghatározását fogadják el. A HbAIC és a többi glikozilált hemoglobin posztszintetikus glikozilálódás során jön létre; mennyiségük arányos a vér glukóztartalmával. Keletkezésük a vörösvérsejt élete során állandóan folyik, így mennyiségük mintegy 3 hónapos szénhidrát-anyagcsere átlagos szintjét tükrözi. Ez utóbbi jelenti a meghatározás fő diagnosztikus értékét, A korábban közölt eljárások elsősorban a glikozilált hemoglobin komponensek, ezen belül a HbAIC meghatározásán alapulnak, más glikozilált fehérjék meghatározására nem alkalmasak (Trivelli L. A., Ranny, H. M., Lai, H. T.: New England Jour, of Med. 1971. 284. kötet, 353. oldal). Többségük a glikozilált hemoglobin kromatográfiás elválasztására épül, így nem a hemoglobinhoz kötött összes glukóz mennyiségét adják meg, hanem csak a p-lánc N-terminális aminocsoportján glikozilált hemoglobinra (HbAIC) kalibrált százalékos értéket. A jelenleg forgalomban levő vegyszerkészletek is csak a fenti speciális célra, azaz a HbAIC meghatározására alkalmasak és egyes környezeti tényezőkre (pl. a laboratórium hőmérséklete) igen érzékenyek. A kromatográfiás módszerekkel szemben, egyszerűbb és sorozatmérésre alkalmassá tehető a Flüekiger és Winterhalter által kidolgozott kolorimetríás módszer (FEBS Letters 71, 356, 1976). E módszer lényege, hogy a fehérjék aminocsoportjaihoz kondenzációs reakcióval kötődő és Amadori-átrendeződésen keresztülment glukóz savas hőkezelés hatására 5-hidroximetilfurfural alakjában hasad le, amelyet tiobarbitursavval határoztak meg. Ebben a formában a módszer csak vízoldható fehérjékhez kötött glukóz meghatározására alkalmas. Az eredeti eljárásban a meghatározást a kromatográfiás eljárás eredményére kalibrálták, ezáltal kizárólag a Hb Aj c meghatározását célozta. Ezekkel szemben, vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a módszer egyrészt a sejtbe zárt vagy vízoldhatatlan fehérjékre is kiterjeszthető, ha azokat előzetesen híg, ionos vagy nem-ionos detergenssel oldatba visszük. Ez a felismerés lehetővé teszi, hogy a hemoglobinon kívül más, glikozilálódott fehérjék glukóztartalma is meghatározható legyen. Másrészt eljárásunk a kiértékelés során nem a kromatográfiás HbAIe módszerre vonatkoztat vissza, hanem függetlenül a fehérjétől, kizárólag a glukóz-származék extinkciós koefficiensét, keletkezésének és bomlásának arányát veszi figyelembe, ezáltal az eljárást valamennyi fehérjére kiterjesztettük és segítségével a fehérjéhez kötött összes glukóz mennyiségét határozzuk meg. Eljárásunkban új elem az is, hogy az eddig elterjedt — maximum 0,6 mólos — savkoncentrációnál nagyobb. savkoncentrációt alkalmazunk, kombinálva túlnyomásos hőkezeléssel. A savas hidrolízist végezhetjük egy sav segítségével szerves és szervetlen savak keverékével, adott esetben katalizátor jelenlétében is. Savként használhatunk előnyösen oxálsavat, savkeverékként oxálsavat és ecetsavat vagy oxálsavat és kénsavat. A hidrolízis katalizálásához pl. alkalmazhatunk HgCL-t, Ez a megoldás nemcsak a meghatározás idejét rövidíti le, hanem még minden esetben jól reprodukálható eredményekhez vezet. Kísérleteink során megállapítottuk azt is, hogy az eddig alkalmazott eljárásban a fehérjementesítéshez kizárólagosan használt triklórecetsav előnyösen helyettesíthető szulfoszalicilsavval. Ennek a reagensnek a kezelése lényegesen könnyebb és így technológiai előnyt is biztosít. A továbbiakban felismertük még azt is, hogy az eddig a kolorimetríás meghatározásokhoz egyedül felhasznált tiobarbitursav helyett reagensként alkalmazható minden olyan aromás vegyület, amely a savas lebontáskor keletkezett 5-hídroximetil-furfural aldehidcsoportjával kondenzálni tud és ezáltal kiterjedt kettőskötés-rendszert kialakítva (delokalizált rc-elektronok) színes terméket ad. Legalkalmasabbnak erre a célra a barbitursavat találtuk. Le azt is megállapítottuk, hogy a tiobarbitursavval végzett előhívásnál a mérés pontossága fokozható, ha az értékelést 360 nm-nél végezzük. A találmány tárgya tehát eljárás nem-enzimatikus úton glikozilálódott fehérjék glukóz-tartalmának meghatározására savas hőkezeléssel hidroximetil-furfural kialakítása, a fehérje lecsapása, majd a hidroximetilfurfurallal történő színképzés útján. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a sejtbe zárt vagy vízoldhatatlan fehérjéket ionos vagy nem-ionos detergens segítségével oldatba visszük, a glukózt túlnyomás alatt legalább 1 n sav felhasználásával, előnyösen katalizátor jelenlétében 5-hidroximetil-furfural alakjában leválasztjuk, majd a reakcióelegyet fehérjementesítjük, ezt követően az 5-hidroxímetil-furfuralt az ezzel színes terméket adó szerves vegyülettel kondenzáltatjuk, végül a kapott termék koncentrációját spektrofotometriásán meghatározzuk. A találmány tárgyát képezik azok a vegyszerkészle-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6L 2
