186976. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nem-enzimatikus úton glikozilálódott fehérjék glükóztartalmának meghatározására és az eljárás kivitelezésére szolgáló reagens-kittek
4 186976 5 tek (kittek) is, amelyek segítségével a meghatározás sorozatban, mindenkor azonos pontossággal elvégezhető. A találmány szerinti vegyszerkészletek egymástól elkülönítve 1—-3 súlyrész ionos vagy nem-ionos deter- 5 gensből, 60—120 súlyrész hidrolizáló ágensből, 150— 250 súlyrész fehérje-lecsapószerből és 2—6 súlyrész, hidroximetil-furfurallal színreakciót képező anyagból állnak. A találmány szerinti vegyszerkészletek detergens- 10 ként előnyösen nátrium-dodecil-szulfátot, hidrolizáló ágensként előnyösen oxálsavat, fehérje-lecsapószerként előnyösen szulfoszalicilsavat, hidroximetil-furfurallal színreakciót képező anyagként pedig előnyösen barbitursavat tartalmaznak. j 5 A legelőnyösebbnek azt a vegyszerkészletet találtuk, amely egy meghatározáshoz detergensként 2 ml 0,1%os nátrium-dodecilszulfátot, hidrolizáló ágensként 1 ml 1 n oxálsavat, fehérje-lecsapószerként 1 ml 20%-os szulfoszalicilsavat és hidroximetil-furfurallal színreak- 20 ciót képező anyagként 0,5 ml 0,05 mólos barbitursavat tartalmaz, vagyis a legjobbnak ítélt vegyszerkészlet összetétele 50 mérésre a következő: 100 ml 0,1%-os nátrium-dodecilszulfát, 50 ml 1 n oxálsav, 25 50 ml 20%-os szulfoszalicilsav, 25 ml 0,05 mólos barbitursav. Ebben a vegyszerkészletben a fehérjéhez kötött glukóz meghatározásához szükséges vegyszerek súlyaránya: 3Q Na-dodecilszulfát : oxálsav : szulfoszalicilsav : barbitursav = 0,02 : 0,9 : 2,00 : 0,04. A vegyszerkészletben a hemolizáló oldat Na-dodecilszulfát helyett tartalmazhat más detergenst (pl. Triton X 100). Az oxálsavat helyettesítheti 2 n ecetsav, gg kénsav vagy más erős sav. A fehérje lecsapásához alkalmazható a triklórecetsav, a színreakcióban a barbitursav helyett alkalmazható tiobarbitursav vagy más, a hidroximetil-furfurallal színes terméket adó vegyidet. Az eljárás alkalmazását — az oltalmi kör korláto- j(l zása nélkül —- az alábbi példákon mutatjuk be. 1. példa 45 Nem-enzimatikus úton glikozilálódott hemoglobin glukóztartal mának megh atározása a) 3 ml heparinos vért háromszor 10 ml fiziológiás sóoldattal mostunk, majd 1 ml mosott vörösvérsejthez gg 2 ml 0,1%-os nátrium-dodecilszulfát-oldatot adtunk. A keletkező hemolizátum hemoglobin koncentrációját meghatároztuk, majd 2 ml-éhez hozzáadtunk 1 ml 1 n oxálsav-oldatot és 2,5 órán át, 112—115 °C-on, 0,16 MPa nyomás alatt hőkezeltük. A hidrolizátumhoz gg 1 ml 20%-os szulfoszalicilsav-oldatot adtunk cseppenként erős rázogatás közben, amelynek hőmérséklete 40 °C volt, majd a keletkező szuszpenziót centrifugáltuk, a felülúszó fényelnyelését 398 nm-nél leolvastuk (Elérték), majd 2 ml-éhez 0,5 ml 0,05 mólos barbitur- gg sav-oldatot adtunk és az elegyet 40 percig 40 °C-on inkubáltuk. Az elegyet lehűtöttük és 10 percen beliü leolvastuk fényelnyelését 398 nm-nél egy hemolizátum nélkül készített vak oldat ellenében (E2-érték). A glukóztartalom (G) kiszámítása az alábbi képlettel történt: G =2,40 ^2(398) 0>8 E.U—0,20 100 ml hemoglobin (F) X10 2 mól glukóz/ ahol (F) a hemoglobin koncentrációja mól/l-ben. A konstans tartalmazza a barbitursav moláris extinkciós koefficiensét, valamint a savas lebontás során bekövetkező 5-hidroximetil-furfural veszteség korrekciós faktorát ás a hígítást is. Ha a hemoglobin koncentrációját Drabkin módszerével' határoztuk meg, 0,02 ml hemolizátumot mérve 5 ml reagensbe és a fényelnyelést 540 nm-nél mérve (Es40), a képlet a következő volt: G = 4,53 2(398)—Ei(308)—0,20 hemoglobin (Emo) mól glukóz/100 ml A normál értéket a hemoglobin esetében 7,5—12,0 mól glukóz/100 mól hemoglobin-nak találtuk. b) Ebben az eljárásban az «J-ban ismertetettekkel azonosan jártunk el, csak a glukóz meghatározásához 0,05 mólos tiobarbitursavat használtunk és a reakciót 443 nm-nél követtük. A kiértékeléshez az alábbi képleteket használtuk: G = 1,5 ^2(443) 0,8 E.U) 0,14 100 ml hemoglobin (F) X10 2 mól glukóz/ G=2,83 1^2(443) 0,8 Ej^a) 0,14 hemoglobin (E540) mól glukóz/100 mól c) Az eljárás során az aj-ban leírtakkal azonos módon végeztük a vizsgálatot, csak a reakciót az érzékenyebb 360 nm-nél követtük. Ebben az esetben a két képlet a következő: G= 1,05 Ea-(ae°)-0’8(^l(^--QhL4X 10-2 mól glukóz/ 100 mól hemoglobin illetve G= 1,98 mól hemoglobin -0,8 Ejíaaa) 0,14 (E540) mól glukóz/100 Mivel a módszerrel a hemoglobinon kötött összes glukózt meghatároztuk, az eredmény magasabb érték, mint a kromatográfiásan meghatározott vagy arra visszaszámított, nemzetközileg használatos HbAIe érték. A két módszer közötti átszámítási faktor: G/HbAIC = 1,8. 2. példa A vörösvérsejt membrán nem-enzimatikusan glikozilált fehérjéinek meghatározása a) 10 nd heparinos vért háromszor 50 ml fiziológiás sóoldattal mostunk, majd az üledéket nyolcszoros térfogat jeges hemolizáló-oldattal összerázva, 5 percig állni hagytuk. A szuszpenziót ezután centrifugáltuk, a felülúszót dekantáltuk és a visszamaradt membrán 3
