186955. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fájdalomcsillapító és ópiumhatású, új heptadekapeptid előállítására
6 186955 7 nitril, víz 1:9 arányú elegyében feloldjuk és 4,6 mm ;< 500 mm méretű Nucleosil 0 18 oszlopon fordított fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfiát végzünk. A 0,065 térf% trifluórecetsavat tartalmazó actonitril víz elegyet használunk, melynek koneentrációgradiense 20%—40%, átfolyási sebessége 2 ml/perc. A 4. ábra e kromatográfia eredményét mutatja, a szaggatott vonal az acetonitril koncentráció változását, a satírozott rész az aktív részt jelenti. Mint a 4. ábrán látható, az aktív koncentrálódott, és közelítőleg a 30% acetonitril koncentrációnak megfelelő frakcióban mosódott le. A frakciót fagyasztva-szárítjuk, nagynyomású folyadékkromatográfiát végzünk, majd fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással tisztítjuk az anyagot 4,6 mm . 250 mm méretű Nucleosil Phenyl oszlopon. Kifejlesztőoldatként 0,065 térf% trifluór-ecetsavat tartalmazó 30%-os vizes acetonitril oldatot alkalmaztunk, átfolyási sebessége 1 ml/perc. A 280 nm-es és 255 nm-es optikai csúcsnak megfelelő aktív részeket szimmetrikusan eluáljuk. Az 5. ábra az előzőekben említett kromatográfu. eredményét mutatja. Az előállított anyagot tisztaságá nak vizsgálatára szokásos módszerrel denzilezett szár mazékká alakítjuk. 15 nm-ól terméket nyerünk, melynek szerkezetét az (1)—(4) pontokban leírásra került módszerekkel határozzuk meg. (1) Aminosav összetétel 2 nmol peptidet 20 p.1 3-N-merkapto-etán-szulfonsavval 110 °C-on 24 órán át hidrolizáljuk, majd az így szabaddá vált aminosavakat Hitachi Model—835 típusú aminosavanalizátoron elemezzük. A vizsgálat szerint a peptid 17 aminosavból tevődik össze, ezek 2 Asp, 1 Glu, 2 Gly, 1 Prol, 1 lieu, 2 Leu, 1 Phe, 1 Tyr, 2 Lys, 3 Arg és 1 Trp. (2) N-terminális aminosavak azonosítása 1 nmol peptidet 50 pl0,5 n nátrium-hidrogén-karbonát oldatban oldunk és 50 pl 1 mg/ml denzil-kloridot tartalmazó acetonnal összekeverjük, éjszakán át állni hagyjuk. A denzilezett peptid elválasztását vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel végezzük n-butanol, ecetsav és víz 4:1:5 arányú elegyét alkalmazva futtatókén!. A denzilezett peptid 0,3—0,4 R£ értékű foltját Iekapsrjuk, metanol, ecetsav, piridin és víz 1:1:1:1 arányú elegyével eluáljuk. A peptidet hidrolizáló-csőben töményítjük, szárazra pároljuk, majd 100 pl 6 n sósavval 105 °C-on 16 óra hosszat hidrolizáljuk. A sósav Jedesztillálása után a hidrolizátumot 100 pl vízzel telített etilacetáttal extraháljuk. Az oldhatatlan anyagot lecentrifugáljuk, a felülúszót nagynyomású folyadékkromatográfiás készüléken (Waters) 4,6 mm. 250 mm méretű Nucleosil C—18 oszlopon analizáljuk. Eredményül E-Dn-s-lisint és 0,N-di-Dns-trirozint azonosítottunk. Ennek megfelelően az N-terminális aminosav tirozin. (3) A tripszin-hidrolizátum szerkezetének igazolása 5 nmól peptidet 100 pl desztillált vízben oldunk. Az oldathoz 10 pg/ml tripszint (Sigma Co.) és 15 pl 0,1 mmol/1 pH 7,6-os foszfát puffert adunk, majd enzimes hidrolízist végzünk 37 °C-on 1,5 órán át. A hidrolizátumot Waters típusú nagynyomású folyadékkromatográfiás készüléken 4,6 mm. 250 mm méretű Nucleosil C 18 oszlopon, 0,065 %trifluór-ecetsavat tartalmazó 10%—60% között lineárisan növekvő koncentrációjú acetonitril oldattal 4 fragmentumra választottuk. Mindegyik fragmentum aminosavösszetételét megvizsgáltuk, azonosítottuk N-terminális aminosavukat és Edman-féle lebontással meghatároztuk aminósavszekvenciájukat. A következő aminosavszekvenciákat állapítottuk meg: I. fragmentum; Ile—Arg—Pro—Lys II. fragmentum; Arg—Ile—Arg—Pro—Lys III. fragmentum; Leu—-Lys—-Trp—Asp—(Asx Glx) IV. fragmentum; Ryr—Gly—Gly—Phe—Leu—Arg— Arg V. fragmentum; Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu—Arg Az I., II., IV. és V. fragmentumok feltételezett szerkezetének helyességét szintetikus standard mintával történő összehasonlítással támasztottuk alá. A következő irodalmi közlemény az Edman-féle lebontásra vonatkozik. Methods in Enzymology Vol. XLVIL, Part E., p. 335, Ed. Hrs. C. H. W., S. N. Timasheff, Academic Press, New York, 1977. (4) C-terminális aminosavak sorrendjének megállapítása 1 nmol peptidet 1 pg karboxipeptidáz A enzimmel (Sigma Co.) 150 pl 0,1 mol/1 pH 8,0 ammónium-acetát pufferben 33 °C-on inkubálunk a peptid lebontása céljából. A hidrolízis 2. és 16. órájában 50—50 pl mintát veszünk, Hitachi Model—835 típusú aminosavanalizátoron, biológiai folyadék oszlopon vizsgáljuk a szabaddá vált aminosavakat. A maradék 50 pl oldathoz még 1 pg karboxipeptidázt adunk, és további 24 órás hidrolízissel teljessé tesszük a lebontást. 24 óra elteltével az oldatot teljes egészében aminosav analizátorba injektáljuk, a szabad aminosavak mennyiségét meghatározzuk. A vizsgálat eredményeképpen megállapítottuk, hogy a C-terminális aminosav Gin és az azt megelőző aminosav Asp vagy Asn, azaz a C-terminális vég -Asp-Asn-Gln vagy -Asn-Asp-Gln. Másrészt, a tripszines hidrolízis III fragmentumának Edman-féle lebontásából származó eredmény szerint a C-terminálistól számított harmadik aminosav Asp. Ennek megfelelően vizsgálataink szerint a C-terminális aminosavak sorrendje: -Asp-Asn-Gln. Az (1)—(4) vizsgálatok szerint a peptid aminosavszekvenciája a következő: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln 4. Az ábrák rövid leírása Az 1. ábra a példa szerint CM-eellulóz oszlopon végzett kromatográfiás elválasztás elúciós profilját mutatja. A 2. ábra a példa szerint Bio Gel P 6 oszlopon ammónium-karbonát eluens alkalmazásával kapott elúciós profilt mutatja. A 3. ábra a példa szerint Bio Gel P 6 oszlopon ecetsav eluens alkalmazásával kapott elúciós profilt mutatja. A 4. ábra a példa szerint Nucleosil C 18 oszlopon végzett fordított fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfia eredményének grafikonja. Az 5. ábra a példa szerint Nucleosil Phenyl oszlopon végzett fordított fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfia eredménye. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
