186955. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fájdalomcsillapító és ópiumhatású, új heptadekapeptid előállítására
4 186955 5 2. Módszer Az itt leírásra kerülő (A) és (B) módszereket alkalmaztuk. (A) Vizsgáló módszer a tengeri malac ileumának longitudinális izmából készített preparátum alkalmazásával. Kosterlitz, H. W. és munkatársai módszerét alkalmazzuk. Eszerint felnőtt tengeri malac nyaki vénáját átvágjuk, az állatot kivéreztetjük, hasmetszést végzünk, mely után azonnal kivágjuk az ileumot (40-50 cm hosszú szakasz) az ileolocalis régiótól 15-20 cm távolságra levő ponton. A kivágott ileumot azonnal Ringer-oldatba helyezzük, 10 cm-es darabokra vágjuk és ezekről a longitudinális izmokat sebészeti késsel és applikátorral lefejetjük. A lefejtett izmokat fonallal gyűrű alakúvá kötjük össze és 6 cm3 térfogatú, állandó hőmérsékletű üvegcellába helyezzük függőlegesen felfüggesztve. A cella aljában és tetejében elhelyezett platinaelektródákból 80-90 volt feszültség alkalmazásával 0,1 Hz-es, 0,5 msec időtartamú elektromos ingerlést hozunk létre, és az ennek hatására létrejövő összehúzódást transzduktorral regisztráljuk. Ha a cellába mintát viszünk be, az alkalmazott minta mennyisége hat az összehúzódás mértékére. Ezt a hatást használjuk fel az ópium-aktivitás mérésére. E módszer irodalmát tartalmazza a következő közlemény: Kosterlitz, H. W., A. A. Waterfield: Annu. Rev. Pharmacol. 15, 29 (1975). (B) Egérondó-elvezető csövet alkalmazó módszer. Hughes és munkatársai módszerét alkalmaztuk. Eszerint felnőtt, hím egeret dekapitálással kivéreztetünk, hasmetszést végzünk, ami után azonnal eltávolítjuk az ondóéi vezető csövet. Az ondóéi vezető csövekben lévő spermát csipeszekkel kinyomjuk, a jobb és a bal ondóelvezető cső mindkét végét fonallal összekötjük gyűrű formát kialakítva. Ezt a gyűrű az (A) módszerben alkalmazott elektromosinger-keltő készülékbe helyezzük azonos, 0,1 Hz, 1 ms és 90 volt, körülmények között. Mint a tengeri malac ileum hosszanti izma esetében történt, itt is az alkalmazott minta mennyisége szabályozza az elektromos ingerlés következtében fellépő összehúzódás mértékét. Ezt a hatást használjuk fel az ópium-aktivitás mérésére. E módszer irodalmát tartalmazza a következő közlemény: Hughes, H. W., H. W. Kosterlitz, F. M. Leslie: Br. J. Pharmacol. 53, 371 (1975). Az ópium-aktivitás hatása kifejezhető az IC50 (nmól/1) értékben, mely azt a koncentrációt jelenti, amely az elektromos ingerlés által kiváltott összehúzódás 50%-os szintre való csökkentéséhez szükséges, ezért az IC50 értéket mind (A), mint (B) módszerrel meghatároztuk. 3. Eredmények Az eredményeket az 1. táblázat mutatja. 1. táblázat Módszer (A) (B) Minta Morfin 105—25 (15) 220—40 (9) A találmány szerint előállított anyag 0,55—0,15 (6) 6,6—2,4 (6) A táblázatban szereplő értékek az IC50-t (nmól/1), a zárójelben levő számok a minták számát jelentik. Az 1. táblázat azt mutatja, hogy a találmány szerint előállított anyag gátolja a tengeri malac ileum longitudinális izmának elektromos ingerlés hatására töi'ténő összehúzódását, hatása a morfinénak körülbelül százötvenszerese, ugyancsak gátolja az egérondóelvezető cső elektromos ingerlés hatására történő öszszthúzódását, hatása a morfinénak körülbelül harmincszorosa. A következőkben példával alátámasztva részletesen leírjuk a találmányt. Példa Húszezer sertés duodénumából nyert 1 kg VIP-frakciót 30 cm átmérőjű, 70 cm hosszú CM-cellulóz oszlopon engedjünk át, megfelelő mennyiségű (4 1/óra) 20 rnmól/1 foszfát pufferoldattal mossuk, majd lineáris koncentrációgradiensű nátrium-foszfát pufferrel (20 mmól/1, pH 10, 140 1 — 100 mmól/1, pH 12, 140 1) elő lijük. Az előzőekben leírt (A) módszerrel történő biológiai vizsgálat folyamatos végzése közben gyűjtjük az aktív frakciókat. Az 1. ábra a kromatográfiás profilt mutatja, melyben a kitöltött háromszögek a morfinekvivalenciát, a kitöltött körök az OD280 nm-en meghatározott fehérjetartalmat jelentik. Ezt követően az aktív frakciót sóval történő telítéssel kisózzuk, majd két részletben Sephadex G—25 oszlopon (21,5 cm . 81 cm) sómentesítjük, és fagyasztvaszárítjuk, 78 g anyagot nyerünk. Ezután az aktív frakciót előzetesen 20 mmol/1, pH 10-es foszfát puffer oldattal pufferolt CM-Sephadex oszlopon (3,5 cm . 90 cm) engedjük át, ugyanezzel a pufferrel mossuk és lineáris koncentráció gradiensű foszfát puffer oldattal (20 mmol/1, pH 10, 31— 100 mmol/1 pH 12, 31 eluáljuk (107 ml/óra, 15 g/frakció). Az aktivitás-változást a korábbiakban említett biológiai vizsgálattal nyomonkövetve az aktív frakciókat gyűjtjük és 20 g sóval kisózzuk. A kisózott frakciót 4 részre osztjuk és egyenként átengedjük 3 cmX 100 cm méretű Biogel P—6 oszlopon. Először 100 mmol/1 ammónium-hidrogén-karbonáttal eluáljuk, az aktív frakciót fagyasztva-szárítjuk, majd hasonló módon 2,4 cm . 87 cm méretű Bio Gel P—6 oszlopon engedjük át az anyagot, 100 mmol/ecetsav oldattal eluáljuk. A 100 mmol/’l ammónium-hidrogén-karbonát oldattal az aktív frakciót eluáljuk, melynek csúcsa átfedésben van a sóéval, míg a 100 mmol/1 ecetsav oldattal az aktív frakció a só csúcs után különállóan szeparálható. A 2. ábra azt az elúciós profilt mutatja, melyet Bio Gel P—6 oszlop és 100 mmol/1 ammónium-hidrogénkarbonát eluens alkalmazásával nyerünk, a szaggatott vonal a morfin ekvivalensben kifejezett aktivitásokat, a folytonos vonal pedig az OD280 nm-en meghatározott fehérjetartalmat jelenti. A 3. ábra Bio Gel P—6 oszlop és 100 mmol/1 eeetsavoldat alkalmazásával nyert elúciós profilt mutatja, ahol a szaggatott vonal az OD22-, nm-en, a folytonos vonal az OD2S0 nm-en kapott peptidtartalmat jelöli. A satírozott rész jelenti az aktív részt Az elválasztott aktív frakciót fagyasztva-szárítjuk, 1 ml, 0,065 térf% trifluórecetsavat tartalmazó aceto-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
