186955. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fájdalomcsillapító és ópiumhatású, új heptadekapeptid előállítására
2 136955 3 A találmány tárgya eljárás egy új heptadekapeptid és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására. A találmány szerinti eljárással előállított heptadekapeptid fájdalomcsillapító hatású és ópium-hatású; a vazoaktív intesztinális peptidfrakcióban (továbbiakban VIP-frakció) található. A találmány szerinti heptadekapeptid sertésduodénumból nyerhető. Hosszabb ideje végzünk tanulmányokat sertésduodénumból mint nyersanyagforrásból gasztrointesztinális hormonok, mint például szekretin, kolecisztokinin, pankreozimin és vazoaktív intesztinális hormonok kivonására és alkalmazására vonatkozóan. A VIP- frakcióban váratlanul ópium-aktivitással rendelkező anyagot találtunk. Ezért elvégeztük az említett anyag további extrakcióját, tisztítását és vizsgálatát, és úgy találtuk, hogy az említett anyag új primer struktúrával rendelkezik, és ópium-aktivitása százszorosa a morfinénak. Az enkefalin és az endorfin mint endogén morfin hatású anyagok az agyban fordulnak elő, és a különböző testi érzékelések szabályozását, beleértve a fájdalomérzetet és a mentális akciókat is, feltételezik róluk. Enkefalin elnevezés alatt két különböző és feltételezetten eltérő fiziológiás hatású pentapeptidet értünk, a metionin-nekefalint és a leucin-enkafalint. Az is ismert, hogy az endorfin molekulárisán heterogén. így oc-, ß-, y-, S- stb. endorfint ismerünk, ezek közül a 31 aminosavból álló ß-endorfin érzéstelenítő hatása a legerősebb. A következő szakirodalmi közlemények referenciaként szolgálnak, és magukban foglalják az endorfinra vonatkozó általános ismereteket: Beaumont, A., J. Hughes: Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 19, 245. (1979.); Chikara Oyama: Shindan to Chiryo (Diagnózis an Therapy) 68, 825 (1980); Tampakushitsu, Kakusan, Koso: Proteins, Nucleic acids, and Enzymes 26, (2) (1981), special vol. on opioid peptides. Újabban feltételezik, hogy az endogén ópiumhatású anyagokat nemcsak az agy, hanem a test más részei is tartalmazzák. Néhány, valószínűleg enkefalin prekurzornak tekinthető vegyületet az adrenális medullából vontak ki. Az ópium-hatású anyagoknak az intesztinális traktusban való jelenlétét már korábban kimutatták immunológiai módszerekkel, például immúnhisztokémiai, radioimmunológiai és in vitro biológiai vizsgálatokká . Ezeket az eredményeket például Stern, A. S. és mtsai [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 6680—6683 (1979], Kimura, S. és mtsai [Proc. Natl. Acad. Sei. ÚSA, 77, 1681—1685 (1980)] és Mizuno, K. és mtsai (BBRC, 95, 1482—1488 (1980)] közleményei tartalmazzák. Ennek ellenére nincsenek ezen anyagok extrakciójára, tisztítására, szerkezetükre, farmakológiai aktivitásukra stb. vonatkozó ismeretek. Találmányunkban olyan, az intesztinális traktusból kivont anyag előállítását írjuk le, amelynek szerkezete nem tökéletesen ismert. Felismertük, hogy ez az anyag különbözik a korábbiakban említett endogén ópiumhatású enkefalintól és endorfintól, és ópium-hatása a korábbi ismeretek alapján vártnál erősebb. A találmány tárgya tehát eljárás a következő primer szerkezetű heptadekapeptid előállítására: H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln-OH. A képletben Asp aszparaginsavat, Asn aszparagint, Gin glutamint jelent. Ezt a szerkezetet az 1. példában leírásra kerülő vizsgálatokkal határoztuk meg, azaz vizsgáltuk az előbb említett polipeptid aminosavösszetételét, denzilezéssel azonosítottuk N-terminális aminosavát; trípszines hidrolízist követően vizsgáltuk a nyert fragmentumok aminosav-összetételét, azonosítottuk N-terminális aminosavukat és Edman-lebontással meghatároztuk aminosav-szekvenciájukat; vizsgáltuk még a találmány szerint előállított polipeptid karboxipeptidázos hidrolízisekor szabaddá váló aminosavak mennyiségének időbeli változását. A találmány szerinti eljárás végrehajtása során a kivonat tisztítását oszlopkromatográfiás, gélszűréses, kisózásos és fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerekkel végezzük. A találmányunkban szereplő anyagot sertésduodénumból nyerjük ki. Kivonását és tisztítását szokásos módszerek szerint végezzük, a következőkben összegzett módszer példaként szolgál. Első lépésként VIP- frakciókat készítünk sertésduodénumból pl. a Suzuki, Araki és Tachibana [Yakugaku-Zasshi: 99, 172 (1979)] által leírt módszer szerint. Ezt követően a VIP-frakciókat cellulóz-, előnyösen CM-cellulóz- oszlopkromatográfiás dextrán gélen, előnyösen Sephadex G—25 gélen végzett gélszűréses és dextrán, előnyösen CMSephadex oszlopkromatográfiás módszereket tartalmazó eljárással tisztítjuk, besűrítjük. Az aktív frakció meghatározását tengeri malac ileum longitudinális izmát alkalmazó biológiai vizsgálattal végezzük. (Az alkalmazott technikát a kísérleti példa 2., meghatározási módszerekre vonatkozó részében ismertetjük.) Az aktív frakciókat összegyűjtjük, kisózzuk és szilikagélen, előnyösen Bio Gel P—6-on gélszűréssel tisztítjuk. A gélszűrést előnyösen kezdetben gyengén lúgos, majd gyengén savas körülmények között végezzük, ezáltal a relatív aktivitást jelentősen megnöveljük. Ezután az aktív frakciót fagyasztva szárítjuk, majd szilikagél, előnyösen Nucleosil C 18 alkalmazásával fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiát végzünk. Kifejlesztőszerként trifluorecetsav tartalmú vizes acetonitril oldatot használunk 10—40% acetonitril koncentrációgradienssel. A találmány szerinti peptidet felváltva ismétlődő fagyasztvaszárítással és fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával nyerjük ki, végül fenil-szilikagél, előnyösen Nucleosil Phenyl segítségével végzett nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk. A találmány értelmében előállítható olyan gyógyászati készítmény is, mely aktív komponensként a találmány szerinti eljárással előállított heptadekapeptidet tartalmazza gyógyászati szempontból elfogadható hordozók és/vagy hígítók jelenlétében. A találmány szerinti eljárással előállított anyag fájdalomcsillapítóként való használhatóságát a következő kísérleti példa bizonyítja. Kísérleti példa 1. Minta A találmány 1. példája szerinti eljárással előállított anyagot alkalmaztuk vizsgálati mintaként. Kontrolimintául a morfint tekintettük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
