186749. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, biológiailag aktív peptidek előállítására
1 186 749 2 ben, például metilénklorid és dimetilformamid elegyében visszük reakcióba. Miután a kívánt aminosav-sorrend létrejött, a pepiidet például fluorhidrogénnel a hordozó gyantától elválasztjuk. Á fluorhidrogén nemcsak a pepiidet oldja le a gyantáról, hanem az oldalláncok védőcsoportjainak nagy részét is lehasítja. Klórmetilezett vagy hidroximetilezett gyanta alkalmazása esetén a fluorhidrogénes kezelés a szabad peptidsavhoz (W = OH) vezet, míg benzhidrilamin-gyanta esetén a szabad peptidamid (W = NH2) képződik. A klórmetilezett vagy hidroximetilezett gyantáról a pepiidet ammóniával, alkil- vagy diaikilaminnal is leoldhatjuk. Az oldalláncban védett pepiidből így az oldalláncban védeti amid vagy alkilamid (W = NH2 , —NHR) képződik. Az oldallánc védőcsoportját utána önmagában ismert módon eltávolíthatjuk. A peptidsavak, illetve -amidok másrészt a megfelelő peptidészterek elszappanosítása vagy ammonoUzise útján is kaphatók. Hidrazido- vagy helyettesített hidrazido-származékokat a találmány értelmében az N-védett pepiid vagy aminosav és a megfelelően szubsztituált hidrazin, így benzilkarbazát, terc-buiilkarbazát, adamantil-karbazát, fen il - hidrazin vagy adamantil-hidrazin kondenzálásával állítunk elő, vagy pedig úgy, hogy az N-védett pepiidet vagy aminosav-hidrazidot alkalmas alkilezőszerrel, így benziiklórformiáttal, terc-butiikiórformiáttal vág;/ adamantilfluorformiáttál reagáltatj uk. Az alkalmazott jelölések a peptidkémiában szokásosak. A D-aminosavakat kis kezdőbetűkkel jelöltük, így például ala - D-Ala. A példákban megadott Rpértékcket 60 F2S4 jelű szílikagél-lemezeken (Merck; rétegvastagság 0,25 nun, lemezhossz: 20 cm) az alábbi futtató elegyek alkalmazásával határoztuk meg: A rendszer: benzol—eriiaeetát—ecetsav—víz (10:10:2:1)(felső fázis), B rendszer: benzol-etilacetát—ecetsav-víz (100:100:40:15) (felső fázis), C rendszer : n-butanol— ecetsav—víz (4:1:1), D rendszer kloroform-mctanoí-32 %-os ammóniumhidroxid-oldat (65 :45 :20), E rendszer: kloroform-metanol (8:2). A vékonyrétegkromatográfiai elemzést szobahőmérsékleten (20 °C± 3 °C) végezzük, emiatt az R[-értékek ±5 %-kal változhatnak. Az 1,2 pH mellett mért clektroforeíikus mobolitást (glutaminsavra vonatkoztatva) Ei 2 jelöléssel adjuk meg. Az olvadáspontokat nyitott kapillárisban határozzuk meg, a kapott értéket nem korrigáltuk. A legtöbb (I) általános képletű vegyidet olvadás előtt megpuhul és bomlik. A kristályosítás, kicsapás vagy eldörzsöiés során alkalmazott mindenkori oldószert zárójelben a vegyidet után feltüntetjük. A nagyfeszültségű papír-elektroforézishez Piierograph Original Frankfurt 64 típusú készüléket használtunk, a Schleicher und Sebül! cég 2317 sz. elekíroferézis-papírjával. Feszültség: 1600 V (40 V'/cm); pH-éríék: 1,2 (hangyasav/ecetsav/víz 123:100:777), Az (I) általános képletű vegyületek állatkísérletekben értékes farmakológiái hatásokat mutatnak. Különösen a központi idegrendszerre hatnak mint fájdalomcsillapítók, antipszichotikumok és neuroendokrínológiai hatóanyagok. A találmány szerint előállítható peptidek perifériás opioid hatásait a tengerimalac kipreparált hosszanti csipcbéiizmán, továbbá az egér ondővezetékén tanulmányoztuk. A peptidekrek az elektromosan stimulált simaizomzati készítményekre kifejtett hatásának kritériuma a rágásnak az a maximális gátlása volt, amelyet az anyaggal való érintkezés után 5 percen belül megfigyeltünk; minden egyes pepiiddel 3-5 kísérletet végeztünk, in vitro tesztekben. A tengerimalac csípőbelét (ileumát) Gyang és Kosterlitz (Agonist and antagonist actions of morphine-like drugs on the guinea-pig isolated ileum, Br. J. Pharmac, Chemother., 27, 514-527. [1966!) leírása szerint készítettük eiő, és 15 ml térfogatú szervfürdőben függesztettük fel. A szöveteket a módosított Krebs-oidatban helyez ük el, amelyet Kosterlitz, Lydon és Watt (The effects of adrenaline and isoprénaline on inhibitory a and ß adrenoceptors in the longitudinal muscle of the guinea-pig ileum. Br. J. Pharmac.,39, 398-413 [1970]), írtai le, összetétele a következő (millimólban): nátríum-klorid 118, kálium-klorid, 4,75, kalcium-klorid 254, kálium-dihídrogén-foszfát 11,9, magnézium-szulfát 0,12, nátrium-hidrogén-karbonát 25, glukóz 11; tartalmaz továbbá hexametónium-kloridot (0,069 mM), és mepyram ne maisától (0,125 piM), telítve 95 % oxigént és 5 % szén-dioxidot tartalmazó gázkeverékkel. A fürdő hőmérséklrtc 36 C voit. A hosszanti izom rángásszerű összehúzódásait fesziiltségátvivő fejjel (DY 1, Basile, Milano) izoi íctrikusan rögzítettük ésmikrodinamiméteren kijelezve jegyeztük (Basile, Milano). A szervfalon belüli idegeket 0,5 miiliszekundum időtartamú, derékszögű impulzusokkal stimuláltuk, amelyeket 10 másodperces időközikben adtunk, szupramaximálís feszültség alkalmazásával. A csípőbelet általában 3—5 másodpercig érintkez:ettük az. opioid peptidekkel, amíg elértük a maximális gátlást. az egér ondóvezetékét Hughes, Kosterlitz és Leslie (Effect of morphine on adrenergic transmission in the mouse was deferens. Assessment of agonist and antagonist potencies of narcotic anlgesics. Br. J. Pharmac.,53, 371-381. [1975]) leírása szerint készítettük elő. Egy, vagy - ritkábban - két pár vezetéket rögzítettünk 8 ml téríogatú szervfürdőben. A hosszanti összehúzódásokat ugyaniig)' regisztráltuk, mint ahogyan ezt a ter.gerimalaccsípőbél esetében leírtuk. A szöveteket módosított Krebs-oidatban helyeztük el, ennek összetétele a következő volt (miilimólokban): nátrium-klorid Î18, káliumkló id 4,75, kalcium-klorid 2,54, kálium-dihidrogénfos fát 0,93, nátrium-hidrogén-karbonát 25, glukóz 11; tartalmazott továbbá aszkorbinsavat (0,1 mM) és nátrium-acélától (0,027 mM), telítve 95 % oxigénből és 5 % szén-dioxidból álló gázkeverékkel. A fürdőhőmérséklet 36 °C volt. A szerviálon belüli idegeket 1 milliszekundun időtartamú, derékszögű impulzusok sorozatával stimuláltuk, ezeket 15-20 másodperces intervallumokban adtuk, és egy-egy sorozat 6-7 stimulusból állt 100 miiliszekundum időközökkel. Az impulzusok áthaladtak a f. néken elhelyezett platinatűn és egy vertikális irányú, pkrinadrólból kiképzett gyűrűn (5 mm magas cs 10 mm szé.’es), amelyet a szervfürdő tetején rögzítettünk). \ vizsgálati eredményeket az 1. táblázatban közöljük, ahol a l]-Tyr-aIa-Plie-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 ” •’CF3CÖOH hatását Î00-nak vettük, cs az. analógok hatásút moláris alapon,százalékban fejeztük ki. A H-Tyr-a!a-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 —CF3COOH a különböző tesztekben a következő hatást mutatta: a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
