186733. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimet vagy mikroorganizmus sejtet magában foglaló mikroporózus polimer testek előállítására
1 2 gyögysorrá alakítjuk oly módon, hogy vízfürdőbe csepegtetjük, ahol gömbök formájában koagulál. Ily módon körülbelül 800 g nedves gömböt gyűjtünk össze, a nedves gömböket levegőáramban szárítjuk és így 73 g anyagot kapunk. Ezekből a gömbökből 1 grammot 25 °C-on 200 ml vízmentes laktóz-oldattal (4,75 súly%) együtt inkubáljuk, amely 2 millimól MgS04.7H20-t tartalmaz, továbbá 1 millimól EDTA-t foglal magában 0,1 mólos 7-es pH-jú foszfát - -pufferben. Két órás reakcióidő után a laktóz 80%-a glukózzá és galaktózzá alakult, ahogyan a glukózteszt segítségével (Boehringer) végzett glukóz-analízis mutatja. A laktóz hidrolízisét 20 egymást követő alkalommal megismételjük ezekkel a gömbökkel, de semmiféle aktivitáscsökkenést nem észleltünk. 2. példa Poli-(etilén-imin)-nel előkezelt E.coli sejtek abszorbeálásával kapott penicillin-aciláz gömbök 1.105 egységet (száraz súly 20 g) tartalmazó E.coli sejteket 875 g vízben feliszapolunk és a szuszpenziót 25 g 3,3%-os (sú!y%) poli-(etilén-imin)-oldattal kezeljük keverés közben. Az aggregátumképződést - mely könnyen megy végbe - ellenőrizzük. A sejtpasztát ezután ismét feliszapoljuk kis menynyiségű (összesen 127 g) vízben és erőteljesen keverjük 157 g 10 súly%-os acetonos cellulóz-acetát-oldattal. A továbbiakban az 1. példában leírt módon járunk el és így 35 g (száraz súly) gömbalakú anyagot kapunk. Ezekből a gömbökből 5 g-os adagot 37 C- on inkubálunk 400 ml 0,02 mólos 8 pH-jú foszfát-pufferrel készített 6%-os penicillin G oldattal. A kezdeti aktivitás 60.000 egység nagyságú (egy óra alatt hidrolizált penicillin G mikromólban) és a teljes hidrolízis 4 óra alatt megy végbe. Ugyanezek a gömbök 20 egymást követő alkalmazás után (hidrolízis) megtartják kezdeti aktivitásuk 60%-át. ' 3. példa Poli-(etilén-imin)-nel és glutáraldehiddel előkezelt E.coli sejtek abszorbeálásával kapott penicillin-aciláz gömbök 1.106 egységet (száraz súly 20 g) tartalmazó E.coli sejteket 400 g vízben feliszapolunk és a szuszpenziót 25 f 2,2%-os poli(etilén-imin)-oldattal és 5 g 25%-os glutáraldehid-oldattal kezeljük keverés közben 10 percig. A sejteket ülepedés után összegyűjtjük és 157 g 10%-os acetonos cellulóz-acetát oldattal együtt erőteljesen keverjük. A gömböket az előző példákban leírt módon készítjük, így 40 g száraz gömböt kapunk, amelyből 5 g mennyiséget felhasználunk az aktivitás meghatározására a 2. példában megadott módon. Az aktivitás 50.000 egység és a hirolízis valamivel hosszabb idő alatt fejeződött be, mint 4 óra. A glutáraldehiddel készült gömbök változatlanul megtartották kezdeti aktivitásukat szemben a glutáraldehid nélkül készült gömbökkel. 4. példa Poli-(akril-amid)-dal (Prodeflox A/1S) előkezelt Arthrobacter sp. sejtek abszorbeálásával kapott glukóz-izomeráz gömbök 10 liter Arthrobacter sp. sejttenyészethez, amely glukózizomeráz enzimet tartalmaz, a fermentáció befejeződése után hozzáadunk 500 g 0,3%-os Prodefloc A/1S oldatot. A sejt-szuszpenziót 20 percig keverjük és utána a sejteket ülepedni hagyjuk. A sejt-pasztát (száraz súly 150 g) összegyűjtjük és vízzel feliszapoljuk mindaddig, ameddig összesen 600 g összsúly mennyiséget nem kapunk, majd erőteljes keverés közben hozzáadunk 1500 g 10%-os acetonos cellulóz-acetát-oldatot. Az előző példákban megadott módon készítünk gömböket. A kapott gömbökből 1 grammot 60 °C-on inkubálunk 100 ml 50%-os (tf/tf) glukózoldatban, amely 5.10^3 mól MgS04.7HjO-t, 10 4 mól COCI2-t, 0,1 mól Na2S03-at tartalmazó és a pH- ja 7. Polarimetriás mérésekkel meghatároztuk az aktivitást 100 nemzetközi egységben (1 perc alatt termelt fruktóz mikromólban), amely 56% volt (kifejtett aktivitás/meglévő aktivitás). Ezeket a gömböket folyamatosan használtuk 20 egymást követő napon a vizsgálati körülmények között, de az aktivitásuk csökkenését nem észleltük. 5. példa Poli-(etilén-imin)-nel és glutáraldehiddel kezelt enzimoldatot magában foglaló glukóz-izomeráz göm. bök Az enzimoldatot úgy készítjük, hogy 2 g glukóz-izomeráz port feloldunk 8 g vízben. Az oldathoz keverés közben hozzáadunk 4 g 3,3%os poli-(etilén-imin)oldatot és 4 g 2,5%-os glutáraldehidoldatot. Ezt az enzimer készítményt összekeverjük 100 g 10%os acetonos cellulóz-acetátoldattal szobahőmérsékleten. így az előző példákban leírt módon gömböket állítunk elő, amelyeknek a súlya levegőn való szárítás után 12 g. E gömbök egy részét (2 g)60 °Con inkubáljuk 100 ml 50%os (tf/tf) glukózoldattal együtt, amely 5,10“* mól MgS04,7H20-t, 10 4 mól COCl2- t, 0,1 mól Na2S03-at tartalmaz és pH értéke 7, annak érdekében, hogy meghatározzuk az aktivitást, amely 500 nemzetközi egységnek felel meg és a kitermelés 30-40%. 6. példa Poli-(etilén-imin)-t, elválasztóanyagként magukban, foglaló hengeres cellulóz-acetát testek 15 g cellulóz-acetátot feloldunk 85 g acetonban. Az így készített polimer-oldathoz lassú ütemben és keverés közben hozzáadunk 15 g 33%-os (tf/tf) vizes poli-(etilén-imin)-hidroklorid-oldatot és 5 g 1%-os glutáraldehid-oldatot. Az elegyet egy acélhengerbe töltjük, melynek felső része egy nitrogén-palackhoz, alja pedig egy vízfürdőbe merülő szálképző fonófejhez csatlakozik, A nitrogénnyomás növelésével az elegy kinyomódik a szálképző fejből és koagulál, így végtelen szálat kapunk, amelyből 1-2 cm hosszú darabokat vágunk. Az ilyen hengeres testekből 1 gramm mennyiséget kupri-ionokat tartalmazó oldattal érintkeztetünk 4 óra hosszat, amelynek a koncentrációja 18,3 ppm, és amelyet úgy készítünk, hogy CuS04. 5H20-t oldunk desztillált vízben. Egy atomabszorpciós spektrofotométerrel (Varian-Techtron 1200) métjük a hengerekkel érintkező oldat réztartalmát (1,1 ppm). A hengereket 50 ml 1 n HCI-el mossuk és így 17 ppm réztartalmat kapunk. A hengereket ismét 4 óra hosszat érintkeztetjük a réztartalmú oldattal és ismét méijük az oldat réztartalmát, amely ebben az esetben 1,2 ppm. Ezt a műveletet 10-szer megismételtük és a rézelválasztó képcs-186.733 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
