186508. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a reagens a glikozilált hemoglobin-tartalom meghatározására a vércukorszint folyamatos kontrollja során
1 2 A találmány tárgya eljárás a gUkolizált hemoglobin-tartalom meghatározására a vércukorszint folyamatos kontrollja során. Az a tény, hogy cukorbetegeknél megnő a vörös vértestek gliko-hemoglobin-tartama, kihasználható a beteg anyagcserefolyamatainak ellenőrézésére. A vérben ugyanis a glükóz és az eritrocitákban lévő hemoglobin lizinjének láncvégei aminocsoportja, valamint e-aminocsoportja között lejátszódó nem enzimatikus, irreverzibilis reakció által glikolizált hemoglobinfrakciók keletkeznek, melyek a közönséges hemoglobintól kromatográfiásan elválaszthatók. A glikoproteinszintézis az eritrociták teljes, átlagosan 120 napos élettartama alatt folyik, ahol a reakció a vér átlagos glükózkoncentrációjától és annak változásától függ. A teljes HbAi glikohemoglobinfrakció három részfrakcióból áll, ezek a HbAja+HbAjjj+HbAjc A HbA.c-vel jelölt glikozilezett hemoglobin különösen alkalmas vércukorszint kontrolljára. Ezért a HbAj mennyisége, melynek értéke normái felnőttnél a teljés hemoglobin 3-6%-a az eritrocita élettartama alatt az átlagos vércukorszint mutatója. A HbA,c-értéket az eritrociták hemolizisével határozhatjuk meg, többek között a hemoglobinfrakciók kromatorgráfiás elválasztásával makrooszlopon (Trivelli és mtsai: New Engl.J.Med. 284,353-357 /1971/) vagy mikrooszlopon és ezt követő kolorimetriás méréssel spektrofotométeren mintegy 415 mm hullámhossznál. A mikrooszlopon végzett elválasztás teljesen kiszorította a gyakorlatból a makrooszlopos technikát, miután kiderül, hogy a glikozilezett hemoglobin teljes HbAi ib+ic frakciója is mutatja a megfelelő korreláció ufin a vércukorszintet, és a további frakciókra történő felbontás, ami a mikrooszlopon nem lehetséges, elmaradhat (lásd Koenig, R.J., Peterson, C.M. Jones, R.L., Suadek, C., Lehrman, M. és Cerami, A.: Correlation of glucose regulation and hemoglobins Ain*b A, in normal and diabetic subjects, J.Otn Inves. 587820-824 /1976/). Az előállítótól függetlenül valamennyi általánosan használt mikrooszlopos meghatározási teszt ezt a technikát alkalmazza. A teljes HbAj -frakciót egy ioncserélőn egy puffer segítségével, melynek p^-értéke az ioncserélő ionerősségéhez igazodik, elválasztják a maradék hemoglobintól. Vonatkoztatási értékként egy második eluáló oldattal kimossák az oszlopból a maradék hemoglobint és egy megfelelő hemolizátumalikvotból meghatározzák az összhemoglobint. A két értékből számolható a HbAj relatív mennyisége az összhemoglobinban. Lényegeben ugyanezt a technikát alkalmazzák azok a meghatározási módszerek, melyek szerint az ioncserélőn kötött hemoglobint lecentrifugálják (például Leeco Diagnostics). A 3 016 555 DE közrebocsátás! iratban ismertetett eljárás szerint a glikozilált hemoglobint aldehidvegyületté oxidálják, majd 3-metil-2-benzotiazolinon-hidrazon-hidroklorid-monohidráttal reagáltatva kolorimetriásan mérik. A módszer hátránya, hogy a mérendő vérpróbát többszörös kémiai átalakításnak vetik alá. Ismert, hogy a hemoglobin glikozilálása az erítrovitákban kép lépcsőben zajlik, melynek során a glükóz aldehidcsoportja először a hemoglobin Ráncának láncvégei valinjának aminocsoportjával aldiminné (Schiff-bázissá) reagál. Ez ar relatív instabil aldiminszármazék egy Amadori-átrendeződéssel a relatív stabil ketonamin-formára rendeződik át. A nap folyamán bekötvetkező rövid idejű vércukorsüllyedések, ha egybeesnek a méréssel, sok instabil aldimin képződését okozhatják, miáltal a HbAj-érték alkalmazása a diabetikus anyagcsere hosszan tartó kontrolijánál bizonytalanná válik (lásd Schemthaner: Dtsch.Med. Wschr. 106, 259-261 /1981/, J.Ditzel: Diabetologia 19,403404/1980/). A találmány feladata, hogy ezeket a HbAj meghatározási módszereket javítsuk oly módon, hogy a labilis aldimin származékot a hemoglobinfrakciók szétválasztása előtt elimináljuk. A találmány tárgya' tehát eljárás a glikozilált hemoblobin-tartalom meghatározására vércukorszint folyamatos kontrollja som az eritrociták hemolizise, a hemoglobinfrakciók kromatográfiás szétválasztása és kolorimetriás mérése útján, oly módon, hogy az instabil glükóz-aldimin-hemoglobin vegyületek kizárása érdekében a hemolizátumot egy primer aminnal és egy hidrazinvegyülettel reagáltatjuk és az ily módon előkezelt hemolizátumot a kromatográfiás oszlopra visz- , szűk. Meglepő módon azt találtuk, hogy a HbAj-frakció labilis aldiminformája primer amin hatására nidrazinvegyület jelenlétében a megfelelő Schiff-bázis képződése közben egyszerű átschiffeléssel elbontható, amely a hemoglobin stabil glükóz-ketoaminformájának meghatározását a kromatográfiás szétválasztás, illetve spektroszkópiai mérés közben nem zavaija. A találmány szerinti eljáráshoz primer aminként felhasználhatunk minden vízben jól oldódó amint, amelynek legalább egy szabad NH2 -csoportja van. Ilyenek például a hidroxil-aminok, alkil-aminok, így például etil- vagy propil-amin, hidroxi-alkil-amlnok, így etanol-amin vagy aminosavak, így lizin vagy valin, valamint a piridoxamin vagy anilin. Hidrazinvegyületként alkalmas maga a hidrazin, valamint szubsztituált származékai, így a fenil-hidrazin, szemikarbazid. A hidrazinvegyülettel kimbinált primer amint előnyösen az eritrociták hemolizisének azon lépcsőjéhez adagoljuk, amely szükséges a hemoglobin felszabadulásához. Ennek során olyan hemolizis-reagenst alkalmazunk, amely mind a primer amint, mind a hidrazinvegyületet tartalmazza. 1. példa A találmány szerinti reagens egyik különösen előnyös kiviteli alakja a következő komponensekből áll: 200 mmól szemikarbazid-hidroklorid 20 mmól lizin 20 mmól valin 50 mmól pH=ő,6-os foszfátpuffer 8,013 mmól digitanin egy liter vizes oldatban. A találmány szerinti eljárás során a HbAi -érték meghatározásához általában firssen vett vért használunk. Ha ez nem lehetséges, akkor a vérhez antikoagulánsként heparint vagy etilén-diamin-tetraecetsavat adunk, ami a meghatározást nem zavaija. Az ily módon stabilizált vért legfeljebb 1 héten keresztül tárolhatjuk hűtőszekrényben. A mintegy szobahőmérsékletű (20-23 °C) vért a találmány szerint a primer amint és a hidrazinvegyületet tartalmazó hemolizisreagenssel elegyítjük, majd rövid ideig keveijük. Az elegyet mintegy 10 percen keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk a hemolízis és a labilis adlmin talál-186.508 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
