186454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 11béta, 21-dihidroxi-2'-metil-5',bétaH-1,-4-pregnadieno [16, 17-d]-oxazol-3,20-dion előállítására
2 186454 3 A találmány tárgya új eljárás 11/3,21-dihidroxi-2'-metil-5'0H-l,4-pregnadieno [16,17- -d] oxazol-3,20-dion előállítására, a 11^,21-dihidroxi-2,-metil-5’ó H-4-pregneno f 16,17-d ] oxazol-3,20-dion a1 -helyzetben történő mikrobiológiai dehidrogénezésével, Arthrobacter simplex fajhoz tartozó mikroorganizmusokkal koball(II)ionok jelenlétében végzett fermentáció útján. Az előállított vegyület melyet Deflazacort szabad jelzéssel hoznak forgalomba, értékes kortikoid. Saját kísérleteink azt mutatták, hogy a llfl ,21-dihidroxi-2,-metil-5’fl H-4-pregneno [16,17—d J oxazol-3,20-dion mikrobiológiai úton végzett a* -dehidrogénezését nem lehet olyan egyszerűen megvalósítani, mint más hasonló szteroid vegyületekét. Az említett kiindulási anyagnak ismert szteroid- a1- -dehidrogénező mikroorganizmusokkal (például Bacillus lentus ATCC 13 805, Bacillus sphnericus ATCC 7054, ATCC 7055 és ATCC 12 488, Bacillus subtilis NRRL B 558, valamint Nocardia corallina ATCC 4273 és 4275) végzett fermentációja nem megy végbe kielégítő eredménnyel, részben azért, mert a szubsztrátum csak nagyon kis mértékben alakul át, részben azért, mert a szubsztráluinot a mikroorganizmusok nagy mértékben metabolizálják. Azt találtuk, hogy a llfl,21-dihidroxi-2’-metil-5’iOH-4-pregneno [16,17-d] oxazol-3,20- -dion mikrobiológiai úton végzett A1 -dehidrogénezését jól meg lehet valósítani, ha az említett szubsztrátum dehidrogénezésére az Arthrobacter simplex fajhoz tartozó mikroorganizmus-törzset alkalmazunk. Alkalmas Arthrobacter simplex törzsként például az IFO (3550), az ATCC 13 260 és különösen az ATCC 6946 szám alatt nyilvántartott törzseket nevezzük meg. Meglehetősen régóta ismert dolog, hogy az Arthrobacter simplex - melyet korábban Corynebacterium simplex-nek neveztek - szteroidok a1 -dehidrogénezésére képes mikroorganizmus. Ezt a baktériumfajtát gyakran használják az iparban, mert az előbbiekben felsorolt egyéb szteroid- a1 - -dehidrogénező mikroorganizmusokkal szemben az Arthrobacter simplex alkalmazása azzal az előnnyel jár, hogy az átalakítás lényegesen gyorsabban megy végbe vele, mint a többi mikroorganizmussal. Másfelől azonban az Arthrobacter simplex alkalmazása az alábbi két hátránnyal jár: 1. Hosszabb fermentációs idő esetén a mikroorganizmus gyakran hajlamossá vélik a szteroidok metabolizálására, ami a kívánt termék tekintelében jelentős kitermelési veszteséget okozhat, továbbá 2. hajlamos arra is, hogy a reakciót leállítja amikor még 1-3X kiindulási szteroidvegyület van a fermentlében. Ez - gyakran jelentős mértékben - megnehezíti a terméknek a gyógyszer-hatóanyagoktól megkövetelt tisztasággal történő előállítását. Az említett hátrányos jelenségeket a 11 û,21—di— hidroxi-2’-metil-5’í H-pregneno[ 16,17-d] oxazol-3,20-dion fermentációjánál is meg lehet figyelni. Azt találtuk, hogy ezeket a hátrányokat ki lehet küszöbölni, ha az Arthrobacter simplex-8zel végzett a1 -dehidrogénezést a fermentációs közeg egy literjére számítva 0,04-0,12 g kobalt(U)ion jelenlétében valósítjuk meg. Alacsonyabb koballion-koncentráció alkalmazása nem ad említésre méltó eredményt, magasabb koncentrációban pedig a kobaltionok inhibitorként viselkednek. Kobalt(Il)ionokat szolgáltató, alkalmas vegyületként a vízben oldható kobaltsókat, mint például a kobalt(II)-kloridot, a kobalt(ll)-nitrátol, a kobalt(II)-szulfátot vagy a kobalt(II)-szulfát-viz(l/7)-et [régebbi nevén kobaltoszulfát-heptahidrát s = CoSO<.7HjO] nevezzük meg. Az eljárás megvalósítása szempontjából ezen sók anionjának nincs jelentősége, mivel a kobalt(Il)sók a táptalajban disszociálnak. A találmány szerinti eljárást egyébként olyan körülmények közöLl valósítjuk meg, melyek szteroidoknak az Arthrobacter simplex specieshez tartozó mikroorganizmusokkal végzett mikrobiológiai a* -dehidrogénezésére általában alkalmazni szoktak. A szóbanforgó mikroorganizmus számára szokásosan használt tenyésztési körülmények között a tenyésztés egy erre alkalmas tápoldatban szubmerz kultúrában, levegőztetés közben történik. Ezután adjuk hozzá a tenyészethez a szubsztrátumot, amelyet előzőleg valamilyen alkalmas oldószerben oldunk, vagy előnyösen emulgeálunk. A fermentálást ezután addig folytatjuk, amíg a szubsztrátum maximális átalakulását elérjük. A szubsztrátum oldására alkalmas oldószerek közül példaképpen a metanolt, az etanolt, glikol-monometil-étert, a dimelil-formamidot és a dimetil-szulfoxidot említjük meg. Különösen előnyös oldószer a hexametilfoszforsav-triamid. A szubsztrátum emulgeálásál például úgy valósítjuk meg, hogy azt mikronizáll formában, vagy valamilyen vízzel elegyedő oldószerben (például metanolban, elanolban, acetonban, glikol-monometil-éterben, dimelil-formamidban vagy dimetil-szulfoxidban) oldva, erős turbulenciával fúvókán keresztül vízbe nyomjuk. A víz (amely előnyösen mésztelenitett) valamilyen szokásos emulgoálószerl tartalmaz. Alkalmas emulgeálószerek a nem ioriogén emulgeátorok, mint például az etilén-oxid-adduktok vagy a poliglikolok zsírsavakkal képezett észterei. Alkalmas emulgeátorként a kereskedelemben kapható nedvesítöszerekel, mint például a Tegin'*\ Tagat'**, Tween'** és Span1** néven forgalomban levő készítményeket nevezzük meg. A szubsztrátum koncentrációjának, továbbá a szubsztrátum-beadagolás idópontjá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
