186454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 11béta, 21-dihidroxi-2'-metil-5',bétaH-1,-4-pregnadieno [16, 17-d]-oxazol-3,20-dion előállítására
nak, valamint a fermentáció idejének optimuma az alkalmazott mikroorganizmustól és annak tulajdonságaitól függ. Ezeket a paramétereket esetenként úgynevezett elökisérlelekkel kell meghatározni. A szteroidok mikrobiológiai átalakításánál ez egy olyan általános követelmény és fogás, amely a szakemberek.előtt jól ismert. Az alábbiakban következő Példa a találmány szerinti eljárás közelebbi bemutatására szolgál. Ebben a kiviteli Példában a „protein-hidrolizálum"-ot az Organic Synthesis, Col. Vol. I, 194. oldalán ismertetett előírás szerint, proteintartalmú anyagból (toll-liszt) kiindulva állítottunk elő, de a hidrolízis elvégzése után az anyagot ammóniával semlegesítettük és sterilre szűrtük. A kapott szűrletel azután minden további tisztítás nélkül „protein-hidrolizátum"-ként használtuk. a) Arlhrobacter simplex ATCC 6946 törzs száraz kultúráját leöblítjük és ezzel beoltunk egy kétliteres Erelenmeyer-lombikban lévő 1 liter steril tápközeget, melynek összetétele az alábbi: 0,5% kukoricalekvár (50%-os szilárdanyag-tartaloni, gyártó: Freres Roquette, Franciaország), 0,5% glükóz-monohidrát, 0,1% éleszlőkivonat, (80% szilárdanyag-lartalom, gyártó: Ohleség, Hamburg), pH = 7 értékre beállítva. A beoltott tápközeget 30 #C hőmérsékleten 72 órán át 180 fordulat/perc sebességgel rázaljuk. b) 50 literes fermentorban 30 liter steril táptalajt beoltunk 1 liter fenti Arlhrobacter simplex tenyészettel, majd ezt az előtenyészetel 30 °C hőmérsékleten levegőztetés (2 m’/óra) és keverés (220 fordulat/perc) közben 24 órán át inkubáljuk. A táptalaj összetétele: 0,5% kukoricalekvár, (50%-os szilárdanyag-tartalom, gyártó: Freres Roquette, Franciaország), 0,5% glükóz-monohidrát, 0,1% éleszlőkivonat, (80% szilárdanyag-tartalom, gyártó: Ohleség, Hamburg), 4 ml Silikon SH, tip. Sh 780, 4 ml Pluronic, poliélerglikol (gyártó: Wyandotte) (utóbbi két komponens habzásgálló hatású) pH = 7 ériekre beállítva. c) 15 g 11/),21-dihidroxi-2’-melil-5’flH-4-pregneno- [ 16,17—d 1 oxazol-3,20-diont, melynek olvadáspontja 114/118-130 °C, feloldunk 300 ml hexametil-foszforsav-diamidban, majd az oldatot sterilre szűrjük. d) 12 g kobalt(II)-szulfát-víz(l/7) (régebbi nevén kobalto-szulfát-heptahidrát = CoSO«.7HaO] és 12 g ammónium-szulfát [(NHOiSO,] 500 ml vízzel készített oldatát előbb pH = 6,5 értékre beállítjuk, majd sterilizáljuk. e) 50 literes fermenlorba beadagolunk 30 ml steril tápközeget, melynek összetétele: 0,5% kukoricalekvár, (50%-os szilárdanyag-tartalom, gyártó: Freres Roquette, Franciaország), 0,5% glükóz-monohidrát, 0,3% prolein-hidrolizátum, 4 ml Silikon SH, tip. Sh 780, 4 ml Pluronic, polietilénglikol (gyártó: Wyandotte) (utóbbi két komponens habzásgátló hatású), pH = 7 értékre beállítva. Ezt beoltjuk 3 liter Arlhrobacter simplex előtenyészeltel (b) pont), majd levegőztetés (2 m’/óra) és keverés (220 fordulat/perc) közben 6 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ekkor hozzáadjuk a tenyészethez a jelen példa c) pontja szerint előállított steril llö,21-dihidroxi-2’-inetil-5’íH-4-pregneno [ 16,17—dl 1 oxazol-3,20-dion-oldatol és a jelen példa d) pontja szerint készített oldatot, amely az adalékanyagokat tartalmazza. Ezután a fermentációt még 20 órán keresztül folytatjuk. A fermentáció befejezése után a kapott fermentátumot 5 liter elilén-dikloriddal stabilizáljuk, majd három ízben, alkalmanként 20-20 liter elilén-dikloriddal extraháljuk. Az elilén-dikloridos kivonatokat forgó bepárlókészülékben legfeljebb 50 °C hőmérsékleten vákuumban bepároljuk. Az anyagot ezután tisztítás céljából aluininiuin-oxidon kromalografáljuk. Ily módon 11,4 g lli,21-dihidroxi-2’-metil-5’/)H-l,4-pregnadieno fl6,17-d] oxazol-3,20-diont állítunk elő, melynek olvadáspontja 210/212-220 #C. A találmány szerinti megoldásnak az az előnye, hogy kobaltionok jelenlétében a kiindulási anyag álalakulása 100%-os, enélkül csak 90%-os. A kitermelés kobaltionok nélkül 15%-kal kisebb. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás Ili,21-dihidroxi-2,-metil-5’-/}H-1,4-pregnadieno[ 16,17-d]oxazol-3,20-dion előállítására, azzal jellemezve, hogy 1 lß,21— -dihidroxi-2’-metil-5’iH-4-pregnenof 16,17- -d]-oxazol-3,20-diont Arlhrobacter simplex élő tenyészetével fermentálunk, a fermentációs közeg egy literjére számítva 0,04 g-0,12 g koball(U)ion jelenlétében. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás 1 li ,21-dihidroxi-2’-melil-5’iH-l,4-pregnadieno [16,17-d] oxazol-3,20-dion előállítására, azzal jellemezve, hogy a lli,21-dihidroxi-2’-metil-5,iH-4-pregiierio [16,17-dl -oxazol-3,20-dionl hexametil-foszforsav-triamidban oldva, 2-7 BÚly%-OB oldatban adjuk a tenyészethez. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 00 65 4
