186375. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív enkefalin-származékok előállítására
11 186375 4. A gyantát metanollal kétszer kimossuk. 5. A gyantát metanol és diklór-metán 1 : 1 arányú elegyével kimossuk. 6. A gyantát diklór-metánnal kétszer kimossuk. 7. A gyantát dimetil-formamid és diklór-metán 1 : 1 arányú elegyével háromszor kimossuk. 8. A gyantát 120 percen át a kívánt aminosav-származék 2,5 egyenértéknyi mennyiségének dimetil-formamid és diklór-metán 1: 1 arányú elegyével készült oldatával, és diciklohexil-karbodiimid 1,25 egyenértéknyi mennyiségének diklór-metánnal készült oldatával kezeljük. 9. A gyantát dimetil-formamid és diklór-metán 1: 1 arányú elegyével négyszer kimossuk. 10. Megismételjük a 4—6. lépéseket. b) lépés L-Tirozil-D-alanil-glicil-DL-p-fluor-fenil-alanil-L-(Na-metil)-metionin-amid, hidrogénfluorid Az a) lépésben nyert, gyantához kötött pepiidet 0 °C hőmérsékleten, csökkentett nyomáson, anizol jelenlétében egy órán át vízmentes hidrogén-fluoriddal kezeljük. Utána az illékony összetevőket csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a gyantához kötött pepiidet dietil-éterrel eldörzsöljük, és kiszűrjük, ily módon eltávolítjuk a maradék hidrogén-fluoridot és anizolt. A peptidet úgy választjuk el a gyantától, hogy a keveréket 10%-os ecetsavval kivonatoljuk. Az ecetsavas kivonatot fagyasztva szárítva 745 mg nyers, cím szerinti vegyületet kapunk. c) lépés A végtermék előállítása kromatográfiás tisztítás útján A diasztereomer peptidek nyers keverékét egy fordított fázisú (C18) szilikagélen, egy 5 x 72 cm méretű oszlopon, kis nyomáson (kb. 5 bar) kromatografáljuk, eluensként 26% acetonitrilt tartalmazó 0,1 n ammónium-acetát-oldatot használunk. Az első 2000 ml eluens öszszegyűjtése után 17,0 ml térfogatú frakciókat szedünk, egy-egy frakció 1,5 perc alatt gyűlik össze. A 36—65. frakciókat egyesítjük, és fagyasztva szárítjuk, ily módon a kívánt végterméket kapjuk, a 78—110. frakciókat ugyancsak egyesítve és fagyasztva szárítva a megfelelő D-p-fluor-fenil-alanil-származékot kapjuk. Mindkét terméket külön-külön egy 2,5 x 100 cm méretű oszlopon, Sephadex G—10-en kromatografáljuk, eluensként 0,2 n ecetsavat használunk, ily módon eltávolítjuk az ammónium-acetátot. A megfelelő frakciókat fagyasztva szárítva amorf, fehér színű, szilárd anyagok formájában kapjuk a peptideket. 1. A 4-helyen L-p-fluor-fenil-alanint tartalmazó származék (253,8 mg): [a]n = +14,4° (c=0,5, 1 n HC1). W32|5 = +57,8° (c=0,5, 1 n HC1). Analízis a C3!H43FN6OgS (678,876) képlet alapján: számított : C : 54,85 ; H : 6,39 ; N : 12,38 ; F : 2,80 ; talált: C: 55,05; H: 6,17; N: 12,62; F: 3,07. Aminosav-analízis : Gly Alá Tyr NH3 Phe(F) peptid% 1. 0,99 1,00 1,00 0,98 1,03 97,1 2. 1,01 1,00 1,00 1,00 1,05 96,8 2. A 4-helyen D-p-fluor-fenil-alanint tartalmazó származék (223,1 mg): [oc]d =+5,14 (c=0,5, HC1). Analízis a C31H43FN608S (678,876) képlet alapján: számított: C: 54,85; H: 6,39; N: 12,38; F: 2,80; talált : C : 54,62 ; H : 6,58 ; N : 12,59 ; F : 2,49. 12 Aminosav-analízis : Gly Alá Tyr NH3 Phe(F) peptid% 1. 1,00 1,00 1,01 0,99 1,04 95,2 2. 0,99 1,00 1,00 1,09 1,03 96,4 2. példa L-Tirozil-D-alanil-glicil-L-p-fluor-fenil-alanil-L-p-metoxi-fenil-glicin-amid, acetát-só a) lépés Boc-L-p-metoxi-fenil-glicin-amid (Boc-terc-butoxi-karbonilcsoport) 50 ml tetrahidro-furánhoz hozzáadunk 5,03 g (17,9 millimol) Boc-p-metoxi-fenil-glicint, az elegyet szárazjég és aceton keverékével — 9 °C hőmérsékletre hűtjük, majd hozzáadunk 1,99 ml (17,9 millimol) N-metil-morfolint és 2,34 ml (17,9 millimol) klórhangyasav-izobutil-észtert. Az elegyet 2,5 percig keverjük, majd a hűtött re ikcióelegybe 1 órán át gázalakú ammóniát vezetünk. Utána hozzáadunk 80 ml desztillált vizet, majd 80 ml etl-acetáttal kirázzuk. Az etil-acetátos részt 1 n kálium-hidrogén-karbonát-oldattal, utána 1 n sósavval, és végül vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk és az oldószert ledesztilláljuk. Ily módon fehér színű, szilárd anyag formájában 4,77 g terméket kapunk, amelyet etil-acetát és petroléter elegyéből átkristályosítva 3,32 g tisztított termékhez jutunk, hozam: 49%. b) lépés L-p-Metoxi-fenil-glicin-amid, sósavas só 32 g (12,0 millimol), az a) lépésben leírt módon nyert termék 6,0 ml ecetsavval készült oldatához hozzáadunk 4,7 ml trietil-szilánt és 4,7 ml anizolt. Ezután az elegyhez hozzáadunk 47 ml (3 egyenérték) 0,77 n, ecetsavas sósavoldatot. A reakcióelegyet 35 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd hozzáadunk 600 ml dietil-étert, és a kapargatás útján nyert fehér színű csapadékot kiszűrjük, majd dietil-éterrel mossuk. Ily módon 2,53 g (hozam: 66%) cím szerinti vegyületet kapunk. c) lépés NM-butoxi-karbonil-DL-p-fluor-fenil-alanil-L-p--metoxi-fenil-glicin-amid 0,65 g (3 millimol), a b) lépésben leírt módon nyert termék 8,0 ml dimetil-formamiddal készült szuszpenziójához 0 °C hőmérsékleten hozzáadunk 0,52 ml (3 millimol) diizopropil-etil-amint, ezután hozzáadjuk 0,85 g 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
