186330. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új tieno-piridinon származékok előállítására
5 186330 6 vizsgálata egyértelműen bizonyítja a vérlemezkék aggregálódását gátló és az antitrombotikus hatást. 1. Vérlemezkék aggregálódását gátló hatás A kísérleteket patkányokkal végezzük, orálisan 100—100 mg hatóanyagot beadva 3 napon át a —48, —24 és —2 órában, 0 órakor az elaltatott állat nyakeréből 4 ml-es vérmintát veszünk a Renaud-módszerrel. Ezt a citráttal kezelt vért használjuk azután az aggregálódási meghatározásokhoz. a) ADP által kiválasztott vérlemezke-aggregálódás meghatározása Mágnesrúddal ellátott mágneses keverőn elhelyezett kisméretű üvegpohárba gyorsan beleöntünk 2 ml citráttal kezelt vért, majd néhány másodperces keverés után a pohárba egy milliliter vérre 0,66 [Lg adenozin-difoszfátot (ADP-t) tartalmazó 0,4 ml oldatot adagolunk. 5 másodperces keverést követően két 0,5 ml-es vérmintát veszünk, és az egyik mintát 0,5 ml EDTA-formaldehid-oldattal, míg a másik mintát csak 0,5 ml EDTA-oldattal keverjük össze. Az EDTA-formaldehid-oldat adagolásának célja a vér stabilizálása és így az aggregáció rögzítése, míg ezzel szemben csak az EDTA adagolásának hatására az összes aggregálódott vérlemezkék dezaggregálódnak. Mindkét keveréket ezután 10 percen át állni hagyjuk, majd ezt követően 5 percen át alacsony fordulatszámú centrifugálásnak vetjük alá a vörös vértestek eltávolítása céljából. Ezt követően a felülúszó, vérlemezkékben dús plazmát (angol rövidítéssel : PRP-t) eltávolítjuk, hígítjuk és lemezke-számlálásnak vetjük alá. Az aggregálódás mértékét a következőképpen számítjuk ki!: a nem aggregálódott lemezkék %-a = EDTA-formaldehidben a lemezkék száma---------------------------------------------------------100 EDTA-ban a lemezkék száma Minél közelebb van az így kiszámított százalékos érték a 100-hoz, annál nagyobb a kísérleti vegyület gátló hatása a vérlemezkék aggregálódására. így megállapítható volt, hogy az öt patkányból álló és az (I) képletű vegyülettel kezelt csoportnál az említett százalékos érték 44 + 13, míg az ugyancsak öt patkány ból álló kontrollcsoportnál a százalékos érték 6+2. b) Kollagén által kiváltott vérlemezke-aggregálódás megállapítása 0,5 ml, citráttal kezelt vérhez 1 ml térfogatra vonatkoztatva 0,10 ml, 10 p.g kollagént tartalmazó oldatot adagolunk. A vérlemezkék számolását megszakítás nélkül végezzük, az elegyet állandóan keverve. A szabad vérlemezkék számának csökkenését az idő függvényében folyamatosan követjük és görbeként ábrázoljuk, amelynek meredeksége adja meg az aggregálódás kezdeti sebességét. Az öt patkányból álló és az (I) képletű vegyülettel kezelt csoportnál a kezdeti aggregálódási sebesség 2,33 ±1,18, míg az ugyancsak öt patkányból álló kezeletlen kontollcsoportnál 12,44 + 2,65. A vérlemezkék aggregálódásának gátlásában kifejtett hatás tanulmányozását összekapcsolhatjuk a vérzési idő tanulmányozásával. Az e célra alkalmazott módszer a Stella, L., Donáti, M. B. és de Gaetano, G. által a Thromb. Rés., 7. 709—716 (1975) szakirodalmi helyen ismertetett módszer adaptálása. A kísérletet előzetesen 65 órával, 41 órával vagy 17 órával korábban 200—200 mg (I) képletű vegyülettel (amelyet 10 ml/kg mennyiségben vett 5%-os vizes gumiarábikum-oldatban szuszpendálunk) orálisan kezelt patkányokon hajtjuk végre úgy, hogy pentobarbitállal végzett altatást követően a farkukat a végüktől számított 5 mm-nél levágjuk, majd a kiömlő vért 15 másodpercenként gondosan felitatjuk anélkül, hogy a sebhez érnénk. A hemosztázisos állapotot akkor tekintjük bekövetkezettnek, amikor a vérzés 1 percre abbamarad. A vérzési időt másodpercekben fejezzük ki, és az 1200 másodperc (20 perc) fölötti időket már egyáltalán nem jegyezzük fel. Megállapítható volt, hogy a csak gumiarábikummal kezelt kontrolloknál az átlagos vérzési idő 390 másodperc, míg az (I) képletű vegyülettel kezelt állatoknál több mint 1200 másodperc. 2. Antitrombotikus hatás Ezt a hatást kétféle módszer szerint vizsgáljuk. a) Kísérleti trombózisos módszer selyemszálon E kísérlet elve a Teruhiko Umetsu és Kazuko Sanai által a Thromb. Haemost., 39. 1 (1978) szakirodalmi helyen ismertetett, extrakorporeális keringést alkalmazó kísérleti trombózisos módszer adaptációja. Intraperitoneális pentobarbitál-injekcióval altatott patkány baloldali nyakerét és jobboldali extemális karotid artériáját elzárjuk. Az artériás-vénás sönt (shunt) egy centrális és két laterális katéterből áll, a centrális részbe fehér természetes selyemből készült szálat vezetünk és a vérkeringést 20 percre helyreállítjuk. A vérkeringés leszorítással történő leállítása után a szálat óvatosan eltávolítjuk, majd azonnal megmérjük a súlyát. Egy ugyanilyen kezeletlen selyemszálnak az átlagos súlyát előzetesen már megállapítottuk. A söntön a vérnek az átvezetését megelőző 48, 24 és 2 órával a patkányokat orálisan 200 mg/kg testsúly dózisban az (I) képletű vegyülettel kezeljük, miután azt 10 ml/kg mennyiségben vett 5%-os gumiarábikumoldatban szuszpendáltuk. A kontrollpatkánynak csak 5%-os gumiarábikum-oldatot adagolunk. így megállapítható, hogy 10 patkányból álló kontrollcsoportnál az átlagos trombus-súly 38,62 ±1,18 mg, míg az ugyancsak 10 patkányból álló kezelt csoportnál 25,00 +6,42 mg (-35%). b) fémtekercset alkalmazó, vénatrombózisos módszer Ez a módszer a Friedman és munkatársai által az Am. J. Physiol., 199. 770—774 (1960) szakirodalmi helyen ismertetett módszer adaptációja. Fémtekercset (a fogászok által paszta töltésére alkalmazott eszközt) méretre vágunk, majd patkányok alsó vena cavajába illesztjük. A patkányokat 48 órával, 24 órával és 2 órával korábban orálisan 200 mg/testsúlykg dózisban az (I) képletű vegyülettel kezeljük, az utóbbit 10 ml/kg 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
