186309. lajstromszámú szabadalom • Reagens thrombocyta-szám és fehérjevérsejt-szám meghatározására
3 186300 4 A találmány tárgya teljes vérből thrombocyta-szám és fehérvérsejt-szám normál fénymikroszkopikus úton történő egyidejű meghatározására alkalmas reagens. Ismeretes, hogy mind a thrombocyta-szám, mind a fehérvérsejt-szám meghatározása a klinikai laboratóriumok standard módszerei közé tartozik. A thrombocyta-számlálás többféle módon végezhető el: 1. Elektronikus részecskeszámlálás thrombocyta - számlálásra kifejlesztett automatákkal. Bár ez a módszer gyors és egyszerű ; előfeltétele azonban drága műszerek beszerzése, és egyes esetekben nem helyettesíthetők a mikroszkópos meghatározások. Az eljárás reprodukálhatósága is rosszabb a mikroszkópos számlálókénál. 2. Fáziskontraszt-mikroszkóp segítségével végzett thrombocyta-számlálás kokainos-, novokainos- vagy egyéb thrombocyta-számláló oldattal. A vizsgálat elvégzéséhez a fáziskontraszt-mikroszkóp nélkülözhetetlen, további jelentős hátránya, hogy a vizsgálatot végző személy számára fárasztó, szemrontó, különösen nagy vizsgálati szám mellett. 3. Thrombocyta-szám meghatározása festékes módszerrel : ez a legegyszerűbb és mikroszkóppal elvégezhető módszer. A jelenleg használt festékes módszerek kristály-ibolyát (gencián ibolya, kémiai neve : hexametil-para-rozanilin-hidroklorid) használnak festékként és velük szemben azonban az a jogos kifogás merült fel, hogy a fáziskontraszt meghatározásához képest torzítanak, eltérést okoznak, mert nem festik meg valamenynyi thrombocytát jól láthatóan. A fehérvérsejt-számlálás a legáltalánosabban alkalmazott módszer a haematológiai diagnosztikában. A magyar gyógyszerkönyvben (Ph. Hg. VI.) ismertetett Türk-oldat erre a célra általánosan bevált és elterjedt, de alkalmatlan a thrombocyta-szám meghatározására, pedig számos esetben a két elterjedt laboratóriumi vizsgálatra együttesen van szükség. A thrombocyta és a fehérvérsejtszám teljes vérből normál fénymikroszkóp segítségével történő meghatározásához egy olyan festékoldatra van szükség, mely : a) a vörösvértestek teljes hemolízisét létrehozza a thrombocyták és fehérvérsejtek számbeli redukciója nélkül, b) egyaránt fixálja a thrombocyfákat és a fehérvérsejteket, c) olyan festéket tartalmaz, mely nagy affinitással kötődik az előbb említett alakos elemekhez, így ezeket normál fényben vizualizálja. Az első két követelménynek eleget tévő oldatot ugyan sikerült kifejleszteni [Scand. J. Clin. Invest. 33, 121 (1974)], de csak fáziskontraszt-mikroszkóppal végezhető el vele a thrombocyta-számlálás. A találmány célja tehát olyan festékoldat előállítása, amellyel teljes vérből normál-fénymikroszkóp használatával elvégezhető a thrombocyta és fehérvérsejt meghatározása úgy, hogy az ismert reagensek említett hátrányai kiküszöbölhetők. Kísérleteink során arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy a haemolizáló-fixáló oldatnak nagy affinitású, bázikus festékkel való kombinálásával olyan reagens oldatot kapunk, amellyel a thrombocyta- és fehérvérsejt-szám együtt meghatározható, és normál fénymikroszkóp elegendő a vizsgálat elvégzésére. Ezen két feltétel akkor teljesíthető, ha a haemolizáló-fixáló oldat és a festék között nincsen precipitáció formájában megnyilvánuló inkompatibilitás. Megelőzendő az, hogy akárcsak mikroszkopikus méretű precipitátumok kialakuljanak, mert ezek a kicsapódások thrombocyta jelleget ölthetnek, torzítva ezzel a meghatározás eredményét. A fenti feltételeknek az eddig használt kresil-ibolyatípusú festékoldatok csak részben tesznek eleget, mert a számláló oldat kresil-ibolya festékkomponense gyengén bázikus karakterű ; ennek eredményeként a thrombocyták viszonylag halványan festődnek, a fehérvérsejteket pedig nem tüntetik fel egyértelműen. Kísérleteink során felismertük, hogy a kívánt célra az ún. tiazin-típusú festékek kiválóan alkalmasak. Ezek jellemzője, hogy két kromofor-csoporttal rendelkeznek. A tiazin-típusú vegyületeket az orvosi gyakorlatban már több területen, pl. baktériumfestésben, hisztokémiában már alkalmazták, de ebből még egyáltalán nem volt várható fenti felismerésünk és erre semmiféle szabadalmi utalás nincsen. A vegyületcsoport legfontosabb képviselői a toluidin-kék (lásd I. képlet), a tionin (lásd II. képlet) és a metilén-kék (lásd III. képlet). A fentiek alapján a találmány thrombocyta-szám és fehérvérsejt-szám normál fénymikroszkopikus úton történő egyidejű meghatározására alkalmas reagens, amely abban áll, hogy 0,1—5 súlyrész acetont, 0,05—2,0 súlyrész formaldehidet vagy glutáraldehidet, 0,001—0,1 súlyrész tiazin-színezéket, előnyösen toluidin-kéket, 0,1—2,0 súlyrész ásványi sót, előnyösen nátrium-kloridot és a fennmaradó részben vizet tartalmaz. A találmány szerinti reagens célszerűen 0,1—5,0 súlyrész acetonból, 0,05—2,0 súlyrész formaldehidből, 0,001—0,1 súlyrész toluidin-kékből, 0,1—2 súlyrész nátrium-kloridból áll. A találmányban használt festékek különleges előnye abban áll, hogy rendkívül nagy affinitással rendelkeznek a thrombocyták és fehérvérsejtek savanyú makromolekuláihoz is, ennek eredményeként igen intenzív, markáns vizualizálást érhetünk el alkalmazásukkal. A találmány szerinti reagens legfontosabb előnye, hogy az ismert reagensek érzékenységét jelentősen felülmúlja. Ezt az alábbi vizsgálatok igazolják: Ismeretlen thrombocyta- és fehérvérsejt-számú mintából kapott adatokat 20, egymást követő thrombocyta- és fehérvérsejt-szám meghatározása során nyertünk. Sejtszámlálásnál a vizsgálatok pontossága akkor kielégítő, ha a standard eltérés 10% alatt van. 218,8 G/l-es thrombocyta-szám mellett a SD= +5,0-nek adódott, ezen értékek felhasználásával a variációs koefficiens, standard eltérésként %-ban kifejezve 2,28 (1. ábra). Megjegyezzük, hogy G/l érték az Sí-rendszerben megadott thrombocyta- és fehérvérsejt-számot jelenti. [G/l=giga(sejtszám) (1 = 109/1).] (1. ábra.) A fehérvérsejt-számolás optimális hibája 5,08 G/l atlag mellett SD= ±0,042, ami 0,8%-os variációs koefficiensnek felel meg (3. ábra). Összehasonlító kísérletet végeztünk a találmány szerinti reagens-oldattal thrombocyta-számlálás szempontjából a Gödecke-cég által THROMBOFIX® néven forgalomba hozott thrombocyta-számláló készítménnyel, továbbá — fehérvérsejtszámolás szempontjából — Türk-oldattal 41 beteg véréből paralell thrombocyta- és fehérvérsejtszám-meghatározásokat végezve. Eredményeinket Descartes-i koordinátarendszerbe foglaltuk (2., 4. ábra), s Hewlett—Packard HP—90 szá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
