186121. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagyttisztaságú A-ristomycin és/vagy ristomycin-származék előállítására és ezt tartalmazó reagens thrombolyta aggregációs vizsgálatokhoz
I 186121 különíthető szakaszt tartalmaznak. Kisebb, mint a 0,8 mg/ml koncentráció esetén agglutinációt nem észleltünk. A 0,8—2,0 mg/ml-es tartományban lineáris összefüggést figyelhettünk meg. 2,0 mg/ml-nél nagyobb koncentrációk esetén a dózisgörbék a felső értékcsúcs irányába haladnak, a dózist tovább emelve a plazma-protein-precipitáció egyre zavaróbb tényezővé válik. Azonos eredményeket figyelhetünk meg akár citrát, akár EDTA PRP-t használtunk szubsztrátként. A 2. ábrán mutatjuk be, hogy a ristomycin jól használható a Vili R: Ag kofaktor aktivitásának kvantitatív meghatározására. A Willebrand-betegségben mutatkozó plazma-faktor deficit mérésére az un. ristocetín-kofaktor assay vizsgálatok szolgálnak [J. Clin. Invest. 52, 2708 (1973); Thromb. Diath. Haemorrh. 34, 306 (1975)]. Eredményeink alapján a ristomycin kitűnően alkalmazható kvantitatív vizsgálatokra is és a ristocetin-kofaktor és ristocetin-kofaktor assay vizs; gálat helyett jól bevált a ristomycin-kofaktor és ristomycin-kofaktor assay vizsgálat. A ristomycin-kofaktor meghatározást mind mosott (2. ábra felső görbe), mind formalinnal kezelt thrombocytákkal (2. ábra alsó görbe) elvégezhetjük. A ristocetin és ristomycin nagy koncentrációknál plazma-protein precipitációt eredményez. Az 1,5—3,5 mg/ml közötti értékeknél nyert adatokat tünteti fel az I. táblázat. 1. táblázat Koncentráció (mg/ml) Fény-abszorpció (mérés 600 nm-nél) Ristocetin Ristomycin 1,5 0,01 0,01 2,7 0,07 0,02 3,0 0,15 0,55 3,5 0,66 2,02 Mint látható az általunk használt ristomycinnel mindig nagyobb abszorpció értéket észleltünk, mint a ristocetinnel. Meglepő módon azonban azt találtuk, hogy vizsgálati módszerünk megbízhatóságának alapvető feltétele, hogy a meghatározáshoz felhasznált reagens nagytisztaságú és állandó hatóanyagtartalmú A-ristomycint illetve származékot tartalmazzon. Erre valószínűleg az ad magyarázatot, hogy noha a ristocetin és ristomycin antibakteriális hatása alapján hasonló, az őket előállító mikroorganizmusok jelentősen különböznek egymástól. így a táptalaj összetételétől és a bioszintézis anyagcserefolyamataitól függően még azonos feldolgozás mellett is — mások és mások lehetnek a kísérő szennyeződések. Továbbá ismert, hogy mind a Nocardia lurida NRRL 2430, mind a Proactinomyces fructiferi var. ristomycini tenyészfolyadékában két-két biológialilag aktív komponens képződik. Antibakteriális gyógyszerként használva az antibiotikumot, az A-ristomycinben a B-komponens jelenléte nem okoz gondot, mivel a patogén mikroorganizmusokkal szemben mindkét anyag hatásosnak bizonyult. Sőt, a B-komponens baktericid hatását lényegesen aktívabbnak találták, mint az A-komponensét. Ezzel szemben mindkét antibiotikum esetében a haematológiai vizsgálatokhoz csak az A-komponens tekinthető értékesnek. Erre utal JENKINS és misai közleménye [Thromb. Rés. 7, 531 (1975)], akik azt találták, hogy a B-ristocetin nem aggregálja a normális humán thrombocytákat. Ismert, hogy a fermentáció és az ioncserés letisztítás lúgos körülményei között mindkét ristomycin molekula bomlást szenvedhet. Ennek tisztázására kísérleteinkhez modell vegyületként előállítottuk a karboxi-A-ri; tomycint és azt taláituk, hogy az már nem aggregálja a nomális humán-íhrombocyta-plazmát és nem gátolja az A-ristomycin indukálta aggregációt. Tehát a rendkívüli érzékeny glikopeptid molekula C-terminális metoxi-karbonil-csoportjának lúg hatására lejátszódó hidrolízise (és az esetlegesen ezt követő retro-aldol hasadás mindkét béta-hidroxi-fen'ilszerin egységen) haematológiai célokra teljesen értéktelenné teheti az A-ristomycin prepatárumot. Tapasztalataink szerint ezen nemkívánatos kísérőanyagoktól a korái ban használt vizes-alkoholos átkristályosítás útján sem sikerült megszabadulnunk. Ezen túlmenően a ristomycin-bázis rendkívüli higroszkópos tulajdonságokkal is rendelkezik. Például levegőn való állás közben, néhány perc alatt, saját súlyára számítva több mint 15% nedvességei képes felvenni Ez az oka, hogy a preparátumból pontos súlyú bemérést eszközölni csaknem lehetetlen. Ugyanakkor meglepődve tapasztaltuk, hogy mindennapos laboratóriumi gyakorlatban alkalmazott foszforpentoxidos szárítás közben, szobahőmérsékleten az A-ristomycin minták aggregációs aktivitása iireverzibilis károsodást szenved. Az ;em kétséges, hogy az antibiotikum kinyerése során a preparátumot kísérő esetleges szennyeződések, konkrétan a B-kom.ponens és a különböző lúgos degradációs termékek kimutatására az eddig ismert teszt mikroorganizmusokat alkalmazó biológiai vagy ultraibolya spektrofotometriás hatóanyagtartalom meghatározás és specifikus optikai forgatóképességi értékmérés egyedül nem lehet kielégítő. Az említett kísérőanyagok ugyanis szintén rendelkeznek 280 mm-nél ultraibolya-fény abszorpcióval és hasonló irányú optikai ío gatóképességgel. A találmányunk szerint nagy tisztaságú (I) általános képletu A-ristomycint és/vagy ristomycin-származékot oly módon állítunk elő, hogy vagy a nyers ristomycin bázisból 30—-50%-os vizes oldatot készítünk és ennek az oldatnak a pH-ját ásványi savval, előnyösen hígított kénsavval 6,7 és 7,0 közé. célszerűen 6,8-ra állítjuk; vagy a szennyezett A-ristomycin-monoszulfát fentiéi kel megegyező vizes oldatának pH értékét lúgoldattal, előnyösen ammónium-hidroxidda! 6,7 és 7 közé állítjuk be, majd az oldathoz 20—50% (v/v) mennyiségben vízzel elegyedő, rövidszénláncú karbonsa' nitrilt, célszerűen acetonitrilt adunk szobahőmérsél leten. Ezután az A-ristomycint 4 °C-on kikristályosítjuk, elkülönítjük, tisztítjuk, majd adott esetben a nyert kristályokat szerves oldószerben, célszerűen 1—5 szénatomos alkanolban oldjuk, majd savanhidrid-tipusú acilezőszerrelj előnyösen tiifluor-ecetsavhid. iddel acilezzük, 0--20 °C hőmérsékleten. Ezt követően a nyert termék(ek)et elkülönítjük. Az by módon nyert A-ristomycint vagy származékát vizes puffer-oldatban, előnyösen trisz-hidroxi-aminometán vizes oldatában feloldva thrombocytaaggregációs vizsgálatra, elsősorban a SVillebrand-be-5 ;o 15 20 25 30 35 40 4 b 50 55 60 65 3
