186121. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagyttisztaságú A-ristomycin és/vagy ristomycin-származék előállítására és ezt tartalmazó reagens thrombolyta aggregációs vizsgálatokhoz
1 186121 2 tegség diagnosztizálására alkalmas reagenst állítunk elő. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint úgy járunk el, hogy az ismert fermentációk után előállított nyers ristomycin-bázisból desztillált vízben való oldással szobahőmérsékleten 30—50%-os töménységű oldatot készítünk. Ezután ásványi savakkal, célszerűen hígított kénsavval az oldat pH-ját 6,7—7,0 közé állítjuk. Kiindulhatunk nyers A-ristomycin-szulfátbói is, ilyenkor az oldást követően a kívánt pH-értéket híg lúgoldattal, alkalmasint ammónium-hidroxid-oldattal állítjuk be. Az optimális pH-érték biztosítását műszeres méréssel vagy előnyösen bróm-timolkék indikátornak sárgából égszínkék átcsapásán végezzük. Az így készített oldathoz ezután 20—50% (v/v)-nyi vízzel elegyedő alkil-nitrilt, előnyösen acetonitrilt adagolunk, amikoris megindul a kristályosodás. A nagyobb tisztaságú nyerstermék kristályosításánál azonban eljárhatunk úgy is, hogy a fentiek szerint készített A-ristomycin-szulfát vizes oldatához először 15—50% (v/v)-nyi acetonitrilt adagolunk, ezután a kívánt módon a pH-t 6,7—7,0 közé állítjuk, majd az opálos oldatot oldódásig melegítjük és lassan hagyjuk lehűlni szobahőmérsékletre. A kívánt kristályokat a szűrőn acetonnal mossuk, majd vákuum-exikátorban izzított kalcium-klorid és paraffin forgács felett állandó szívatással súlyállandóságig szárítjuk. Az eljárás 60—80%-os hozammal a kiindulási hatóanyag tartalomtól függően nem higroszkópos, nagytisztaságú és kristályos A-ristomycint vagy szulfátot eredményez, amelyek kitűnő aggregációs képességgel rendelkeznek. A találmány egy további előnyös kivitelezési módja szerint úgy járunk el, hogy a nyers A-ristomycint szerves oldószerben, előnyösen alkanolban oldjuk, illetve szuszpendáljuk, majd hűtés közben acilezőszert, pl. trifluorecetsavanhidridet csepegtetünk az elegyhez. A nyers terméket kívánt esetben átkristályosítással tisztítjuk. A találmány szerinti reagens a fenti eljárással előállított standardizált, nagytisztaságú ristomycint vagy ristomycin-származékot tartalmaz, amely súlyállandó, stabil vegyület. A találmány szerinti reagens (védjegyzett nevén: AGGRISTIN-kit) előnyösen 15 mg-os dózisegységeket tartalmaz. A reagens szabad fenolos hidroxilcsoportjai azonban huzamosabb tárolás esetén a levegő oxigénjének jelenlétében, napfény hatására, a thrombocyta-aggregáció szempontjából kedvezőtlen kinoidális struktúrát vehetnek fel. Ezt igazolják a szilárd preparátum hosszabb ideig tartó (40 óra) ultraibolya fény besugárzásával végzett kísérleteink. Ezért a találmány szerinti reagenst a vérzékenységdiagnosztikai kit-ben barna üvegből készült és hermetikusan lezárt Fiolában kell kiszerelni. A találmány legfőbb erényeit az alábbiakban foglaljuk össze: 1. A találmány szerinti eljárással nagytisztaságú (I) általános képletű vegyületek állíthatók elő, melyek kitűnően felhasználhatók véralvadási-tesztekben. 2. A találmány szerinti reagens kitűnően alkalmazható kvantitatív vérplazma-vizsgálatokban, és kedvezőbb mérési tartományt biztosít az eddigi módszerekkel szemben. 3. A találmány szerinti reagens viszonylag stabil, súlyállandó, 100 °C-on sterilizálható, tárolása megoldható. Stabilitási vizsgálatokkal kétséget kizáróan tisztáztuk, hogy a kristályos A-ristomycin-monoszulfát desztillált vizes oldata 0,5—1,0 órán át 100 °C-on lényegesebb károsodás nélkül sterilizálható. Megállapítottuk azt is, hogy az AGGRISTIN-kitben szereplő TRIS-pufferben (pH = 7,4) 15 mg/ml-es koncentrációjú oldat 3 hónapon keresztül, +4°C-on bomlás nélkül tárolható. A találmány szerinti eljárást az oltami kör korlátozása nélkül az alábbi kiviteli példákkal szemléltetjük: 1. példa A-ristomycin-szulfát előállítása (R, Rí, R2, R3 jelentése az 1. igénypont szerinti, R4 = CH3, X = HSO<, Y-H) Az ismert módon (lásd 180 753 sz. szovjet szabadalmi leírást) előállított ristomycin-bázis-nyerstermék 2 g-ját szobahőmérsékleten 5,0 ml deszt. vízben óvatosan 1 n kénsav-oldattal pH = 6,8-ra állítottuk. A sárgás színű, gyengén opálos oldatot kevés csontszénnel derítettük, szűrtük. Az élesre szűrt oldathoz ezután cseppenként, zavarosodásig előnyösen először 15—20% (v/v) acetonitrilt adagoltunk, majd az elegyet szobahőmérsékleten kristálykiválásig hagytuk állni. Szükség esetén ezt a műveletet további, kismennyiségű acetonitril adagolással, két-három napon keresztül többször megismételtük úgy, hogy a kristályosítást a végén 24 órai, jégszekrényben +4 °C-on való hűtéssel fejeztük be. Az így nyert négyzetalakú, fehéres kristályokat a szűrőn összegyűjtöttük, először acetonitril-víz (1:1) jéghideg elegyének 2x1,0 ml-ével, továbbá hideg 2x 2 ml acetonnal mostuk, majd izzított kalcium-klorid és paraffin forgácsot tartalmazó exikátorban szobahőmérsékleten szívatás közben, súlyállandóságig szárítottuk. Hozam: 71%. 2. példa A-ristomycin-szulfát előállítása A kiindulási anyagként használt nyers A-ristomycin-szulfát 1,5—2,0 g-ját szobahőmérsékleten, állandó rázogatás közben 4,0 ml. deszt. vízben oldottuk és az erősen habzó oldathoz 1,0 ml acetonitrilt adagoltunk, kevés aktív szénnel derítettük és szűrtük. Ezután a közeg pH-ját 2 n ammónium-hidroxiddal brómtimolkék indikátor jelenlétében (sárgából égszínkék) átcsapásig (mintavétellel ellenőrizve) neutralizáltuk. Az oldathoz további acetonitrilt adagoltunk zavarosodásig, majd a kristálykiválás megindulását követően a kivált kristályokat vízfürdőn való melegítéssel újra oldatba vittük és lassan szobahőmérsékletre hagytuk lehűlni. A továbbiakban az 1. példában ismertetett módon jártunk el. Kitermelés: 65%. Mindkét módszerrel preparált A-ristomycin-monoszulfát igen jó thrombocyta-aggregációs tulajdonságokkal rendelkezett, és eleget tett a magas minőségi követelményeknek : 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
