186121. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagyttisztaságú A-ristomycin és/vagy ristomycin-származék előállítására és ezt tartalmazó reagens thrombolyta aggregációs vizsgálatokhoz
I 186121 2 A találmány tárgya eljárás nagytisztaságú (I) általános képletű ristomycin- és/vagy ristomycin-származékok — ahol a képletben R hidrogénatomot, Rí O-alfa-D-arabinofuranozil (l-*2)-0-alfa-D-mannopiranozil ( 1 2) -O - [alfa-L-ramnopiranozil]-(l 6)-0-béta-D-glükopiranozil csoportot, R2 2,3,6-tridezoxi- 3 -amino- (NH Y) -al f a- L -ribo-hexapiranozil csoportot, R3 alfa-D-mannopiranozil csoportot, R, 1—4 szénatomszámú alkilcsoportot, X ásványi savmaradékot Y pedig hidrogénatomot vagy C(Z>3—(CH2)„—CO— csoportot jelent, ahol is Z hidrogénatomot vagy halogénatomot, n pedig 0-tól 5-ig terjedő egész számot jelent — előállítására. A találmány ezenkívül thrombocyta-aggregációs vizsgálatokra, különösen Willenbrand-betegség diagnosztizálására alkalmas bilológiai reagensre vonatkozik. Ismert, hogy a vérzékeny betegek szűrővizsgálatakor a funkciók megítélésében thrombocyta-aggregációs vizsgálatok szolgáltatják a leghasznosabb adatokat. A rutinszerűen alkalmazott aggregáló szerek (ADP, adrenalin, kollagén) mellett 1971. óta jelentő szerephez jutott a ristocetin nevű — előzőleg antibiotikumként használt — anyag. HOWARD és FIRKIN nyomán a ristocetin segítségével lehetővé vált a veleszületett vérzékenységnek, a Willebrand-betegségnek gyors és egyszerű felismerése [Thombosis and Diathesis Haemorhagica26 362 (1971)]. A Willebrand-betegség lényege a véralvadás Vili. faktor komplexének molekuláris defektusa. A Willebrand-faktor legfontosabb élettani szerepe a thrombocyta adhézió elősegítése a subendothelialis képletekhez. A Willebrand-faktor hiány vagy minőségi zavara esetén áll elő az a kórkép, melyet Willebrand-betegségnek nevezünk, amely a leggyakoribb veleszületett vérzékenység! forma. A Willebrand-beteg elkülönítése fontos (öröklődés, családvizsgálatok, terápia), továbbá az ilyen kórkép felderítése és kiszűrése műtéti beavatkozások előtt különösen alapvető fontosságú. Vizsgálataink során arra a felismerésre jutottunk, hogy a laboratóriumi gyakorlatban általánosan elterjedő ristocetint a vancomycin antibiotikum család másik tagja a ristomycin tökéletesen helyettesíti. Olcsóbb előállíthatósága és a plazma-protein precipitációban mutatkozó előnyös különbség miatt, haematológiai vizsgálatainkhoz a ristomycint alkalmasabbnak találtuk. Tehát a jelenleg is antibakteriális fertőzések okozta betegségek gyógyítására használatos ristomycint ezen új területen lehetne (diagnosztikai célra) hasznosítani. A ristomycin antibiotikumot szovjet kutatók a Proactinomyces fructifer var. ristomycini kultúrájából főleg SzDSz-3 vagy SzDV-3 kationcserélő gyantaoszlopon történő adszorpció és acetonos ammónia-oldattal vagy ammónium-acetát pufferrel (pH = 9—10) végzett eluciót követően bázis formában izolálták. Később a ristocetinhez hasonlóan a ristomycint is két biológialilag aktív komponensre, az A- és B-ristomycinre különítették el. Az antibiotikum nagyüzemi előállítását is ismertették, majd a kultúrfolyadék és gyártásközi termékek ható anyagtartalmának meghatározására a biológiai értékmérésen kívül polarimetriás és ultraibolya spektrofotometriás eljárást is kidolgoztak [lásd: 180 753 sz. szovjet szabadalmi leírást: Antibiotiki 8, 392 (1962); Antibiotiki 9, 884 (1964); Antibiotiki 10 217 (1965); Antibiotiki 12, 129 (1967); Antibiotiki 16, 786 (1971)]. Az A-ristomycin pontos szerkezetének megállapítása [J. Org. Chem. 39, 2971 (1974); J. Antibiot. 39, 446 (1979); Tetrahedron Letters 21, 2983 (1980); J ACS 102, 7093 (1980)] után vizsgálataink arra irányultak, hogy a vegyület szerkezeti változtatása, illetve a vegyület tisztasági foka milyen mértékben befolyásolja a thrombocyta-aggregációt. A találmány célja tehát az, hogy megállapítsa a biológiai tesztben felhasználható szerkezeti struktúrát, megoldást adjon a hatóanyag igen nagy tisztaságban való előállítására. Kísérleteink során megállapítottuk, hogy savas vagy lúgos közegben az (I) általános képletben szereplő Rí, Rí, R3 és Rt csoportok részleges vagy teljes eltávolítása, valamint azok hidroxil-funkcióinak és az R-csoport (észter-, éter-formában) blokkolása az antibiotikum kedvezőtlen biológiai hatását, esetenként az oldékonyság kedvezőtlen változását idézi elő. így pl. az R4 csoport hidrogénatommal való helyettesítése útján nyert karboxi-A-ristomycin nem aggregálta a humán thrombocyta-plazmát és nem gátolja a ristomycin indulálta thrombocyta-aggregációt. Ugyancsak kedvezőtlennek bizonyult a fenolos hidroxilcsoportokon blokkolt tetra-O-metil-A-ristomycin (R = R) = CH3) származék. A paracetilezett-A-ristomycin pedig a vizsgálathoz szükséges körülmények között oldhatatlan, így a nyert aglyco-A-ristomycin (R = Ri = Rí = R3 = Y=H; R*CH3) agglutinációt keltett, de a pH és oldékonysági viszonyok miatt ez a származék sem tűnt optimálisnak. Jelen ismereteink szerint a B-ristomycin — mely az (I) képletben csupán az R) heterotetraszacharid láncban lévő 2-O-D-arabinofuranozil-alfa-D-mannopiranozil rész hiányában különbözik — szintén nem alkalmas a kívánt diagnosztikai célra. Meglepő módon azt tapasztaltuk vizsgálataink során, hogy a véralvadási tesztben alkalmazott hatóanyag akkor és csakis akkor optimális, ha az igen magas tisztasági fokú és az (I) általános képletben Y = H esetben is, továbbá Y = CF3—CO— csoport jelentése esetén is igen kedvező laboratóriumi diagnosztikai értékű a tisztán előállított anyag. Ezen előzetes eredmények alapján arra a megállapításra jutottunk, hogy a normális humán thrombocyta-aggregáció kifejtéséhez az (I) általános képletben a négy szabad fenolos hidroxil-csoport (R=H), a C-terminális metoxi-karbonil-csoport (Rt = CH3) és az érintetlen ristotetrozil (=Ri)-oldallánc jelentése alapvető feltétel. Felismertük tehát, hogy a nagytisztaságú A-ristomycin, illetve az (I) általános képletben foglalható származékai kiválóan alkalmasak az A-ristocetin indukálta thrombocyta-aggregációs vizsgálatok elvégzésére (1. ábra). Kísérleteinkben hat különböző citrát PRP-t (thrombocyta dús plazma [Platelet rich plasma]) és EDTA (etiléndiamin-tetraecetsav) PRP-t alkalmazva és átlagértéket számítva az 1. ábrán levő görbék pontjait kaptuk. A görbék lefutása azonos, három jól el-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
