186025. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vinblasztinnel konjugált IgG immunoglobulinok előállítására
1 2 tínból, vinblasztin-szulfátból vagy dezacetil-vinblasztinból a 3 szénatomon lévő észtercsoport észért prefrenciális hidrozinolizise, majd ezt követő diazotálás útján, ezt az eljárást például a JMed. Chem., 21, 1. sz. 88-97 (1978) közlemény, valamint a fentebb már idézett 1 463 575 sz. nagy-britanniai'szabadalmi leírás ismerteti. A vinblasztin metanolos oldatban, mérsékelten felemelt hőmérsékleten történő hidrazinolizise útján túlnyomó részt a monohidrazidot kapjuk, ezt azután 0 °C és 10 °C közötti hőmérsékleten, valameny alkalmas vizes oldószerben sósav jelenlétében nátrium-nitrittel reagáltatjuk és így a kívánt (III) képletö azodot (dezacetil-vimblasztinsav-azid) kapjuk. Előállítható a (III) képletű azid oly módon is, hogy a reakciót 5 bC alatti hőmérsékleten folytatjuk le a fent leírt módon, azután az azid elkülönítése nélkül, a reakcióelegy pH-értékét 9-re állítjuk be és valamely vízzel elegyedő oldószert, például dioxánt adunk az elegyhez. Ezután adjuk hozzá az immunoglobulint 9 pH-értékű borát-pufferoldatban, majd a reakcióelegyet szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni. Az azid feleslegét híg ammónium-hidroxid-oldat hozzáadásával elbontjuk és a kapott konjugátumot gélszűréssel tisztítjuk. A fenti módon előállított konjugátum értékelése az ilyen célra jól ismert módszerekkel, például addinitás-kromatográfiával történhet. A konjugátum hatásosságát oly módon értékelhetjük, hogy tumorsejtek szuszpenzióját a konjugátummal kezeljük, majd megszámláljuk a kezelés után életképes sejteket, történhet a hatásosság értékelése tritiummal jelzett uridin felvételének mérése útján is. A fehérje és a hatóanyag koncentrációja a konjugátum-oldatok optikai sűrűségének kétféle hullámhosszon, például 270 és 280 nm-nél történő mérése útján határozható meg, az e mérés során kapott értékeket a szabad hatóanyag és a konjugálásán immunoglobulin ugyanezen a hullámhosszakon történő mérése során kapott értékekkel vetjük össze. A találmány szerinti eljárással előállítható új konjugátumok előnyösen alkalmazhatók különféle rákos megbetegedések gyógykezelésére, erre a célra a konjugátumot hatóanyagként tartalmazó injekció-oldatok készíthetők. A találmány köre tehát kiterjed az új konjugátumokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására is, ezekben a készítményekben a konjugátumot valamely gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal vagy hígítószerrel kevert állapotban alkalmazzuk. Az ilyen célra alkalmas vivőanyagok illetőleg hígítószerek a szakmabeliek előtt jól ismertek. A találmány szerinti eljárással előállítható hatóanyag (a vindezin-molekularészre számítva) 0,01 mg és 2 mg közötti mennyiségben lehet jelen a gyógyászati készítmény adagolási egységében, adott esetben azonban ettől eltérő mennyiségek is alkalmazhatók. A találmány szerinti eljárással előállítható új konjugátumok adagolási mennyiségei széles hatások között változhatnak, felnőtt személyek gyógykezelése esetén a heti adag általában 1 mg/kg és 10 mg/kg között (a vindezin-molekularészre számítva), előnyösen 3 mg/kg és 9 mg/kg között lehet. Megjegyzendő azonban, hogy, az adott esetben alkalmazandó adagolási módon az orvos határozza meg, a szóbajövő körülmények, elsősorban a kezelendő személy állapotának és a beadás módjának a figyelembevételével. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik, megjegyezendő azonba, hogy a találmány köre semmilyen szempontból sincs e konkrét példák tartalmára korlátozva. 1. péld, Vindezin és juh-anti-karcinoembrionális antigén konjugátumának előállítása 6 mg dezactil-vonblasztinsav-hirazidot 340 ß n sósavoldatban oldunk és az oldatot 4 °C-ra hűtjük le. Eztuán 60 jul 10 mg/ml koncentrácuójú vizes nátrium-nitrit-oldatot adunk hozzá és az elegye 14 °C hőmérsékleten keverjük. 5 perc múlva 300 ß n nátrium-hidroxid-oldatot és 120 ß dioxánt adunk az elegyhez élénk keverés közben, majd 280 ß 21,3 mg/ml koncentrációjú juh anti karcino-embionális antigén (CEA) oldatot (0,34 molos, 8,6 pH-értékü borát-pufferoldatban) adunk a reakcióelegyhez. Az elegyet szobahőmérsékleten 2 óra hosszat keverjük, miközben az alegv pH-értékét 0,1 n nátrium-hidroxid-oldattal 9-en tartjuk. Az azid feleslegét azután 60 bl n ammóniumhidroxid-oldat hozzáadásával elbontjuk és az elegyet további 1 óra hosszat keverjük. A kapott terméket egy 1 . 25,5 cm méretű, 20 ml űrtartalmú, Bio-Gel P-6 géllel töltött oszlopon, foszfáttal, pufferezett sóoldattal gél-szűrésnek vetjük alá elkülönítés céljából. A kizárási csúcsnak megfelelő frakciót (2,66 ml) felfogjuk és Lowry módszere szerint elemezzük a fehérjetartalom és differenciális spektroszkópiával a vindezintartalom meghatározása céljából. Az így kapott konjugátum 1 mo! Ig-re számítva 4,6 mól vindezinz tartalmaz. A kiindulási anyagként alkalmazott Ig-t a British Journal of Cancer ismerteti: (1981)44,472- 475. 2. példa A vindezin egér-monoklonális anti-karcino-embrionális antigénnel képezett konjugátumának előállítása 10 mg dezacetil-vinblasztinsav-hidrazidot 0,56 ml n sósavoldatban oldunk és az. oldatot 4 °C hőmérsékletre, hütjük le. Ezután 100 ß 10 mlg/ml koncentrációjú nátríum-nitrit-oldatot adunk hozzá és a reakcióelegyet 4 °C hőmérsékleten keverjük. 5 perc múlva 0,5 ml n nátrium-hb'roxid-oldatot és 0,2 ml dioxánt adunk élénk keverés közben a reakcióelegyhez, majd 0,5 ml 0,34 n‘borát-pufferoldattal (pH =8,6) készített, 15,6 mlg/ml koncentrációjú egér-monoklonális anti-karcino-embrionális antigén-oldatot adunk hozzá. Az elegyet szobahőmérsékleten 2 óra hosszat keverjük, miközben 0,1 n nátrium-hidroxid-oldattal 9 pH- értéket tartunk fenn. Az azid feleslegét 0,1 ml n ammónium-hidroxid-oldat hozzáadásával elbontjuk és az elegyet további 1 óra hosszat keverjük. Ezután a terméket gél-szűréssel elkülönítjük, 1 . 27 cm méretű (21 ml űrtartalmú), Bio-Gel P-6 adszorbenssel töltött és foszfáttal pufferezett sóoldattal egyensúlyba hozott oszlop alkalmazásával. A kizárási csúcsnak megfelelő frakciót felfogjuk (4,07 ml), majd fehérjetartalomra és vindezin tartalomra vizsgáljuk 270 és 280 nm-nél végzett spetroszkópiával. Az így kapott konjugátumot 1 mól Ig-re számítva 2,1 mól vindezint tartalmaz. 3. példa Vindezin és nyúl egér antigén lg konjugátumának előállítása 12 mg dezacetil-vinblasztinsav-hidrazidot 0,67 ml n sósavoldatban oldunk és az oldatot 4 °C hőmérsék-186:025 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
