186025. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vinblasztinnel konjugált IgG immunoglobulinok előállítására

1

2

.186.025

leire hűtjük le. Ezen a hőmérsékleten 120 {A 10 mg/ml koncentrációjú nátrium-nitrit-oldatot adunk hozzá és az elegyét 4 °C hőmérsékleten keverjük. 5 perc múlva 0,6 ml n nátrium-hidroxid-oldatot és 0,24 ml dioxánt adunk élénk keverés közben az elegy - hez, majd 1,0 ml 0,34 mólos borát-pufferoldattal (pH * 8,6) készített, 11,7 mlg/ml koncentrációjú nyúl egér antigén Ig-oldatot adunk az elegyhez. Az elegyet szobahőmérsékleten 2 óra hosszat keverjük 9 pH-érték 0,1 n nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával történő fenntartása mellett.

Az azid feleslegét 0,12 ml n ammónium-hidroxid-oldat hozzáadása útján elbontjuk és az elegyet további 1 óra hosszat keverjük, A kapott terméket ezután gél-szűréssel elkülönítjük, 1,5 .26 cm méretű (46 ml űrtartalmú), Bio-Gel P-6 adszorbenssel töltött és foszfáttal pufferezett sóoldattal egyensúlyba hozott oszlop alkalmazásával. A kizárási csúcsnak megfelelő frakciót felfogjuk (6,22 ml) és fehérjetartalomra, valamint vindezintartalomra vizsgáljuk 270 és 280 nmnél végzett spetroszkópiával. At így kapott konjugátum 1 mól Ig-re számítva 3,2 mól vindenzint tartalmaz.

4. példa

Citotatikus hatás vizsgálata

Egy tenyésztett sejt-kultúrát mikrotitráló kultúra-tálcákon olymódon adagolunk szét, hogy mélyedésenként 10* sejt kerüljön egy-egy adagba. A sejteket 24 óra hosszat nyugalomba hagyjuk, majd a találmány szerinti eljárással előállított koniugátumot hígítás-sorozatával illetőleg egy kontroli-készítménynyel kezeljük őket. 6 napi inkubáció után közvetlen

számlálással meghatározzuk az egyes mélyedésekben ielenlévő sejtek számát, egy invertált mikroszkópohoz 5 kapcsolt kép-elemző segítségével.

Az egyik kísérletsorozatban emberi vastagbél-adenokarcinoma sejtvonalat kezeltünk monoklonális anti-karcinoemberionális antigén antíteshez konjugált vindezinnel, 1 mól Ig-re számítva 2,1 mól vindezint ., Q tartalmazó (a 2. példa szerint előállított) konjugátumu mai, a citosztatikus hatást sejtszámlálással mértük.

Az alábbi táblázatban összefoglalt eredményeket

kaptuk:

A konjugált

Sej tszám/mély edés

A kontroll

koncentrációja

6 nap múlva a

%-a

■j g (jUg/ml vindezin) (átlag ± standard

eltérés) 4 párhuamos kírésletben

0,00

16,3 ± 4,8 . 104

100,0

0,08

13,8 ±2,5 .10“

84,6

20 0,40

12,6 ± 1,9.104

77,4

2,00

10,8 ±3,9.104

66,7

10,00

1,9 ±0,6.10“

11,9

Szabadalmi igénypont

Eljárás IgG immunoglobulínok átlagosan 2-5, kovalens kötéssel kapcsolt (II) képletű csoporttal módosított konjugátumainak előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely IgG immunoglobulint 8,5-9,5 pH-jú vizes közegben, 5-25 °C hőmérsékleten 30 dezacetü-vinblasztinsav-aziddial reagáltatunk.

3 db rajz

Kiadja: Országos Találmányi Hivatal Felelős kiadó: Himer Zoltán o.v.

KÓDEX

4