186025. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vinblasztinnel konjugált IgG immunoglobulinok előállítására
1 2 A találmány tárgya eljárás űj, karcinoma-ellenes szerként alkalmazható immun oglobulin-konjugátumok előállítására. Közelebbről a találmány tárgya eljárás IgG típusú immunoglobulinok általánosan 2—5, kovalens kötéssel kapcsolt (II) képletű csoporttal módosított konjugátumainak előállítására. A találmány szerinti eljárást úgy végezzük, hogy valamely IgG típusú immunoglobulint 8,5-9,5 pH-jú vizes közegben, 5—25 °C hőmérsékleten dezacetil-vinblasztinsav-aziddal reagáltatunk és átlagosan 2—5 (II) képletű csoport hozzákapcsolása útján módosítjuk. A rákos megbetegedések kemoterápiás kezelése során olykor szükség van olyan gyógyszerek alkalmazására, amelyeknek a hatásosságát a kezelt személyre kifejtett nem-kívánatos mellékhatások korlátozzák, állandó törekvése a kutatóknak az ilyen mellékhatások minimumra történő csökkentése. Egy az említett kategóriákba tartozó karcinoma-ellenes gyógyszer az (I) képletű vindezin, amelyet, valamint annak előállítási módját és biológiai aktivitását például az 1 463 575 sz. nagy-britanniai szabadalmi leírás ismerteti. Az immunoglobulinoknak rákellenes anyagokkal való kapcsolását ismerteti a CA 91, 133944 m, és a 94:197486h referátuma. A jelen találmány szerint olyan új konjugátumokat állítunk elő, amelyekben egy IgG immunoglobulin átlagosan 2-5, kovalensen kötött (II) képletű csoporttal van módosítva. A találmány szerinti eljárásban a felhasználásra kerülő immunoglobulin egy antigén-felismerő tulajdonságú antitest. Előnyösen olyan immunoglobulinokat alkalmazunk, amelyek az emberi testben előforduló malignus (rosszindulatú) sejtek felületén megjelenő antigének felismerésére adaptált antitestek vagy ilyen antitesteknek a fragmensei. A találmány szerinti eljárással előállítható új konjugátumok előnyösen alkalmazhatók rákos megbetegedések gyógykezelésére. Ezek a konjugátumok általában hatásosabbak magánál a vindezinnél és kevesebb mellékhatásuk van, ami többek között e konjugátumok ama képességének tulajdonítható, hogy ezek a citotoxikus hatóanyagot a kívánt hatás helyén megnövelt koncentrációban képesek rögzíteni. A találmány köre kiterjed oly konjugátumok előállítására is, amelyek indirekt rendszerben alkalmazhatók, ahol a sejtfelületi antigénre specifikus antitestek felismerésére használhatók. Ismeretesek már az elpusztítandó sejtek felületén megjelenő antigénekre specifikus immunoglobulinok, és ismeretesek a módszerek ilyen immunoglobulinoknak az immunizált állatok szérumából történő kinyerésére vagy monoklonális termékeket kiválasztó hibridómák tenyésztése útján történő előállítására. Az előnyös típusú antitestek az IgG osztálybeli immunoglobulinok. Az ilyen immunoglobulinok néhány jellemző képviselői az alábbiak: 1. karcino-embrionális antigénnel immunizált kecskéből vagy j uhukból származó lg, 2. nyúl akut lomfoblaszt leukémia-ellenes szérumából származó lg, 3. különféle primatesek akut lomfoblaszt leukémia, akut mieloblaszt leukémia, krónikus lomfoblaszt leukémia illetőleg krónikus granulocitás leukémia elleni antiszérumából számlázó lg, 4. tüdő-karcinoma anyaggal immunizált kecskéből vagy juhokból származó lg, 5. humán vas tagbélrák-íui ti testek et kiválasztó egér-hibridomákból származó monoklonális lg, 6. humán melanoma-ellenes antitesteket kiválasztól egér-hibridomákból származó monoklonális lg, 7. humán leukémia-sejtekkel reagáló antitesteket kiválasztó egér-hibridomákból származó monoklonális lg. 8. humán neuroblasztoma-sejtekkel reagáló antitesteket kiválasztó egér-hibridomákból származó monoklonális lg, 9. humán mellrák-antigénekkel reagáló antitesteket kiválasztó egér-hibridomákból származó monoklonális lg, 10. humán petefészekrák-sejtekkel reagáló antitesteket kiválasztó egér-hibridomákból származó monoklonális lg, 11. humán csontrák-sejtekkel reagáló antitesteket kiválasztó egér-hibridomákból származó monoklonális lg A konjugátumok immunoglobulin-fragmensekkel is készíthetők, ilyenek az antitestekből például proteolitikus enzimes emésztéssel nyerhető Fab, Fab', F(ab')2 vagy IgM monomerek. Ezek az anyagok és előállítási módszereik jól ismeretesek a szakmabeliek számára, az említett proteolitikus kezelésre különösen a pepszin és papain enzimek alkalmasak. Az (I) képletű vindezin a 3-helyzetű karboxilcsoport szénatomján keresztül kapcsolódik az immunoglobulinhoz, ez a kapcsolat oly módon létesíthető, hogy a vindezin azid-származékát reagáltatjuk az immunoglobulin anyaggal. A találmány tehát oly eljárás rákellenes hatású szer előállítására, amelynek során valamely immunoglobulint a (III) képletű vindezin-azidszármazékkal reagáltatunk. Ezzel az eljárással a vindezin-hatóanyag előnyös módon, enyhe reakciókörülmények között kapcsolható az immunoglobulinhoz, anélkül, hogy az immunoglobulin eközben szerkezeti változást szenvedne. A fenti eljárást előnyösen vizes közegben, 5 °C és 25 °C közötti hőmérsékleten célszerűen szobahőmérsékleten, 8,5 és 9,5 közötti, előnyösen 9,0 pH értéken folytatjuk le, az eljárás eredményeképpen kovalens kötés létesül egy vagy több vindezín-maradék és az immunoglobulin-molekula szabad aminocsoportjai, például a lizín-maradékból származó amino-csoportok között. Az immunoglobulinhoz kapcsolódó vindezin-maradékok száma függ az eljárásban alkalmazott reaktánsok koncentrációjától, valamint a reakcióidőtől is, az immunoglobulinthoz kapcsolódó vindezin-maradékok átlagos száma 2 és 5 között van. A fenti reakció gyakorlati kivitezelése célszerűen oly módon történhez, hogy a (III) képletű azid valamely alkalmas oldószerrel, például dioxánnal készített oldatát lassan, cseppenként adjuk hozzá az immunoglobulin például 0,34 molos borát-pufferrel 9 pH- értékre tompított oldatához. A képződött konjugátumot azután gél-szűréssel különítjük el és telített ammónium-szulfát-oldatban tároljuk, ez utóbbiból azután a konjugátumot borát-pufferoldattal történő dialízis útján vihetjük ismét oldatba. Tárolható azonban a konjugátum hűtőszekrényben, 4 °C hőmérsékleten, vagy pedig pél9ául -20 °C hőmérsékletre fagyasztott állapotban is. A (III) képletű azid könnyen előállítható vinblasz-186.025 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
