186001. lajstromszámú szabadalom • Eljárás védőhatású protein-antigén előállítására
1 2 tumait tartalmazó anyagokat is - ugyanolyan előnyös immunológiai sajátságokkal rendelkezik, mint maga az antigén, A lenti anyagokat a leírásban funkcionális származékoknak nevezzük. A találmány szerint a protein-antigéneket ismert, az antigének előállítására általánosan használt eljárásokkal állíthatjuk elő. Az eljárások szerint vagy a'parazitákból izoláljuk az antigén-priteineket, vagy kémiailag vagy biológiailag állítjuk elő azokat, például teljes vagy részleges kémiai szintézissel, vagy génsebészeti módszerrel, genetikailag alkalmasan megváltoztatott gazdaszervezet segítségével. A találmány szerinti eljárással előállított protein-antigéneket a paraziták merozoita alakjából izolálhatjuk, az antigénre specifikus monoklónozott ellenanyagok segítségével. A monoklonozott ellenanyag segítségével végzett antigén elválasztást .korábban nem használták a malária antigének tisztítására. A találmány szerint az antigén tulajdonságú proteineket úgy állítjuk elő, hogy (i) a Plasmodium paraziták merozoita alakját tartalmazó vörösvértesteket szolubilizáljuk, (ii) A szólubilizált anyagot a kívánt antigén-proteinre specifikus monoklónozott ellenanyaggal érintkezésbe hozzuk,és (iii) a kapott antigén-ellenanyag komplexből viszszanyerjük az antigén-proteint. A merozoitákat bármely, szakemberek által ismert módon szolubilizáljuk. Olyan körülményeket választunk, amelyek mellett a paraziták nagymértékben proteolizis és denaturáció nélkül szolubilizálhatók. Közelebbről, a szolubilizálást detergens agyaggal - amely ionos vagy nem ionos típusú lehet — előnyösen valamely nem ionos detergenssel végezzük. Detergensként használhatunk például Nonidet P40 (Shell), Triton X-100 (Rohm and Haas), Brij 99 (ICI) védjegyű anyagokat, vagy a Renex 30 néven ismert (Honeywell Atlas Limited poli(oxi-etilén)-(12)-tridecil-éter detergens anyagot. A detergenst 0,01—5 térfogatai végkoncentrációban adjuk a kezelendő anyaghoz. , A találmány szerinti eljárásban használt monoklónozott ellenanyagot önmagában ismert eljárással állítjuk elő, például Mílstein (Scientific American 243,56 /1980/) eljárása szerint. Az ellenanyag előállítására használt eljárás során általában a szóbanforgó parazitával — jelen esetben malária parazitával — egeret immunizálnak például úgy, hogy egy rágcsálókban maláriát okozó parazitával fertőzik az egeret. Ezután a különböző antigéneket felismerő ellenanyag termelésére képes limfocitákat izolálják és ezeket egér mielóma sejtekkel fuzionálva hibridoma sejteket állítanak elő. Minden hibridoma rendelkezik a szülő limfocitára jellemző ellenanyag termelésének képességével, és klónozható. Az egyes hibridomák vizsgálata során egy vagy több olyan sejtvonal kapható, amely ellenanyag, mégpedig a kívánt antigénre specifikus monoklónozott ellenanyag termelésére képes. A sejtvonalat azután nagy mennyiségű monoklónozott ellenanyag termelésére használják, amelyet viszont a kívánt antigén elválasztására és tisztítására használnak fel A találmány szerinti eljárással előállított antigénre specifikus ellenanyag azonosítása egyszerű vizsgálati módszerekkel kivitelezhető, a szakemberek által jól ismert módszerek szerint. Egy sejtvonalat, a belőle származó ellenanyagot és az ellenanyag által felismert, Plasmodium yoeliiből származó antigén azonosítására irányuló kísérleteket Freeman és munkatársai (The Host Invader Interplay, H. Van den Bösche szerkesztő., Elsevier/ North Holland Biomedical Press 1980, 121) ismertettek ugyan, de nem tudtak specifikus antigéneket izolálni és az antigén izolálására használt, monoklónozott ellenanyagot és a sejtvonalat is csak részben jellemezték. A monoklónozott ellenanyagot előnyösen semleges támasztóanyaghoz — például Sepharose-hoz — kötjük, és a szolubilizált anyagot átfolyatjuk az ellenanyagot tartalmazó támasztóanyagon. A műveletet előnyösen oszlopon végezzül el. Az antigént az antigén-ellenyag komplexből a komplex elbontásával nyerjük vissza. A folyamat kivitelezésére alkalmas körülmények a szakemberek által jól ismertek. A protein immunológiai sajátságainak megőrzése mellett a komplex elbontható tiocianát ionokkal - például kálium-tiocinatáttal — végzett mosással, megfelelő detergens jelenlétében. A találmány szerinti eljárással előállított antigénből vakcinát is készíthetünk, amellyel az érzékeny melegvérű gazdaszervezetben malária elleni védettséget válthatunk ki, ugyanakkor fennáll a szervezet Plasmodium parazitákkal való fertőződésének kockázata. A találmány szerinti eljárással a vakcinát úgy állítjuk elő, hogy a találmány szerinti eljárással előállított antigén-proteint gyógyászati lag elfogadható hordozóanyagokkal összekeverjük. Gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagok alatt például folyékony hordozóanyagokat értünk, amelyek segítségével az antigént a kezelendő alanyba juttatjuk. A hordozóanyag például sóoldat lehet. Az antigén-proteint a hordozóanyagban oldhatjuk vagy szuszpendálhatjuk, vagy oldhatóvá tehetjük gyógyászatiig elfogadható detergensek hozzáadásával. A vakcina tartalmazhat ezenkívül egy adjuvánst is, az immunválasz nagyságának növelésére, ezáltal a vakcina hatása növelhető. A találmány szerinti eljárással előállított vakcinákban alkalmas adjuváns például a Freund-féle komplett adjuváns, vagy méginkább a szaponin, a Corynebacterium parvum (coparvax) vagy az alumíníum-hidroxid vagy ezek elegye, illetve más ismert adjuvánsok. A vakcinákat általában úgy formulázzuk, hogy 0,2- 5 mg/ml végkoncentrációban tartalmazzák az antigén-proteint, a vakcina előnyösen 0,5-2 mg/ml, legelőnyösebben 1 mg/ml antigén-proteint tartalmaz. A formulázás után a vakcinát steril tartóba helyezzük, melyet leforrasztunk és alacsony hőmérsékleten, például 4 °C-on tárolunk, vagy liofilizálunk. A malária elleni immunizálás céljára egy vagy több dózis megfelelően formulázott vakcinát kell bejuttatni a gazdaszervezetbe. A javasolt dózis 0,1—2 ml, előnyösen 0,2—1 ml, legelőnyösebben 0,5 ml vakcinát jelent. A jelen találmány szerinti eljárással a fenti módon előállított vakcinának megfelelő dózisban történő alkalmazásával malária elleni immunitást válthatunk ki érzékeny melegvérű gazdaszervezetekben. A találmány szerinti eljárással előállított vakcinát bármely hagyományos módszerrel adhatjuk a kezelendő alanynak, orálisan vagy parenterális (például szubkután vagy intramuszkuláris) injekció formájában. A kezelés állhat egy dózis beadásából, vagy több dózis meghatározott időpontokban történő beadásából. A találmányt a következő példákkal kívánjuk megvilágítani. 186.001 c V* 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
