186001. lajstromszámú szabadalom • Eljárás védőhatású protein-antigén előállítására
1 2 1. példa A hibridoma vonal előállítása Két P. yoclii-re immunizált BALB/c egér lépsejtjeit P3-NS1/1 Ag-4-1 mieloma sejtekkel fuzionáljuk polietilén-glikol jelenlétében, Galfre és munkatársa (Natu*re 266, 550 /1977/) módszere szerint. A sejteket 144 db, 2 ml HAT szelektív táptalajt (Littlefield, Science 145, 709 /1964/) tartalmazó szövettenyészet-lyukba osztjuk el, alaptáptalajként 10% magzati marhaszérummal kiegészített RPMI 1640 táptalajt (gyártja a Slow Laboratories, Clyreshire, Scotland) használunk. 10 nap elteltével a tenyészet felülúszóját P. yoelii-specifikus ellenanyagra vizsgáljuk, indirekt immunofluoreszcenciás módszerrel (IIF). 143 vizsgált tenyészetből 38 pozitív volt. 77 db tenyészet tartalmazott egy, nterozoitákkal kapcsolódó antigénre specifikus ellenanyagot, de csak a gyűrűalak és a trofozoita alak távollétében. Az ellenanyag kötődése nem egyenletes, hanem minden merozoita felületén vagy merozoitán belül egy bizonyos területhez kapcsolódik. Az ellenanyag nem lép reakcióba oldatban levő szabad, ép' merozoitával, ebből arra következtetünk, hogy a kapcsolódás a parazitán belül történt. A fenti tenyészetből úgy állítunk elő klónozott telepeket táptalajjal felülrétegezett fél-szilárd agaron tenyésztjük. A klónozott hibridoma sejtvonal is rendelkezik a sejtekre jellemző ellenanyag kiválasztásának képességével, jelölése WIC 25.77. A WIC 25.77 sejtvonaíat a Pasteur Intézetben helyeztük letétbe, I-161szám alatt, 1981. július 16-án. A hibridoma sejteket az ascites tumor sejtekhez hasonlóan .BALB/C egerekben tenyésztjük tovább, az egerekből származó ascites folyadék és szérum körülbelül 10 mg/ml monospecifikus ellenanyagot tartalmaz. Két másik hibridoma sejtvonal,, a WIC 25.37 és WIC 25,86 is ugyanarra az antigénre specifikus ellenanyagot választ ki, mint a WIC 25,77. 2. példa AP yoeliivel kapcsolódó antigén előállítása A Plasmodium yoelii vérben élő alakját CD-I egerekben tenyésztjük, 80-90% parazitaemia értékig, majd a vörösvértesteket összegyűjtjük és szolubilizáljuk. A szolubilizálást 4 °C-on 50 mól/1 Trsit, 5 mmól/ 1 etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA) és T% Nonidet P40-et (továbbiakban NP40) tartalmazó pH 8-as pufferrel végezzük, amely 1 mmól/1 fenil-metil-szulfonil-" -fluoridot (PMSF), 0,1 mmól/1 tozil-L-lizin-klór-metil-ketont (TLCK), 5 mmól/1 etilénglikol-bisz(-amino-etiJ-éter)-N,N-tetraacetátot (EGTA) és ,5 mmól/1 jód-acetamidot tartalmaz, a proteolitikus aktivitás gátlása céljából. Az elroncsolt sejteket 100 000 g-vel centrifugáljuk, és a vörösvértestek oldható fehérjéit, kis mennyiségű membrán-fehéijét, valamint körülbelül 70% parazita-fehérjét, (melyet in vitro beépülés után a frakcióbal lévő J3S-metionin mennyiségből számolunk ki)'tartalmazó felülúszót összegyűjtjük. A WIC25.77 hibridoma sejteket tartalmazó egerek ascites folyadékából nyert immunglobulint Protein A•Sepharosehoz kötve, majd egyetlen lépésben pH 3 értéken eluálva tisztítjuk. Az immunoglobulin frakciót bróm-ciánnal aktivált Sepharose-hoz kapcsoljuk, 10 ml immunoglobulinhoz I ml duzzadt gélt használunk. Az immunoglobulint tartalmazó adszorbenset alaposan mossuk, oszlopra visszük és 10 mmól/1 Trist, 1 mmól/1 EDTA-t, 1 mmól/1 EGTA-t és 1% NP40-et tartalmazó pH 8,0-as pufferei ekvilibráljuk. A fentebb leírt módon előállított felülúszót a fenti immunoglobulint tartalmazó adszorbenssel töltött és ekvilibrált oszlopon átfolyatjuk, majd azonos összetételű pufferrel átmossuk. A specifikusan kötődő anyagok nem mosódnak ki 5 oszloptérfogatnyi 0,5 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, azonos összetételű pufferrel történő mosás hatására. Az oszlopot ezután 10 mmól/1 Trist, 1 mmól/1 EDTA-t, 1 mmól/1 EGTA-t, 0,01% NP-40-et tartalmazó Ph 8-as pufferrel mossuk, majd azonos összetételű, 2 mól/1 kálium-tiocianátot tartalmazó pufferrel specifikusan eluáljuk az anyagot. Az eluált anyagot újra kromatografáljuk immunadszorbens kromatográfiával a fenti módon. A specifikus eluátumot térfogatának 10%-ra koncentráljuk, majd 10 mól/1 Trist, 1 mmól/1 EDTA-t, 1 mmól/1 EGTA-t, 0,1% NP40-et tartalmazó, pH 8-as pufferral szemben dializáljuk. A mintát egy, a fenti pufferral újra-ekvilibrált oszlopra visszük, majd a megkötött anyagot 10 mmól/1 kálium-tiocianátot tartalmazó pH 8-as pufferral eluáljuk. Az eluátumot koncentrálva és dializálva kapjuk az antigént. 3. példa A P. yoeliihez kapcsolódó antigén biokémiai jellemzése A 2. példa szerint előállított antigén anyagot SDS gél-elektroforézisnek vetjük alá. Egyetlen fahérjesávot kapunk, melynek molekulasúlya 2,35.10 , spektrin heterodimer (2,2 . 10s és 2,4 . lCr molekulasúlyok) referensanyaggal összehasonlítva, 7,5% poliakrilamid-gélt használva. A parazitával fertőzött sejteket nagy specifikus aktivitású .S-metionint tartalmazó közegben inkuválva a jelzett metionin beépül a proteinbe. A jelzett antigén-proteint WIC 25.77 sejtek által termelt monoklónozott ellenanyaggal és Staphylococcus aureus sejteken lévő Protein A-val végzett immunprecipitációval kapjuk, az immun4complex kicsapásával, A fenti módon kapott anyagot SDS-gél-elektroforézissej vizsgáL- va autoradiográfiás módszerrel egyetlen, 2,35 .10'* molekulasúlynak megfelelő sávot kapunk. Ha az antigén-proteint tartalmazó gélszeletet kimotripszin jelenlétében inkubáljuk, peptid hidrolizisterniékek válnak szabaddá. A kapott peptideket pH 4,4 értéknél vékonyréteg-elektroforézisnek vetjük alá, majd a másik irányban butanol-ecetsav-víz-piridin futtató eleggyel kromatografáljuk. A kimotripszines emésztéssel kapott '*'>S-metionin-tartalmú peptidek képe az 1. ábrán látható. Az alapvető vizsgálatok - például perjódsavas-Schiff festés vagy 125I-jódozott Konkavalin A lektin kötődése az akrilamid gélben lévő proteinhez - azt mutatják, hogy a protein nem glikozilált. A glikoziláció hiányára utal az is, hogy a protein nem köthető és eluálható specifikusan lencse lektin-spharoseról vagy búzacsíra agglutinin-sepharose-ról, valamint az a tény, hogy a protein mérete nem változik akkor sem, ha a parazita tunicamycin - a protein N-glikozilálásnak specifikus inhibitora - jelenlétében szintetizálja a fehérjét. A fehérje izoelektromos pontját az O Farrell (J. Biol. Chem. 250, 4007 /197/) által leírt kétdimenziós gél-elektroforézis rendszerben határozzuk meg, azzal a változtatással, hogy első dimenzióban agaróz-poliakrilamid-gélt használunk. Ha Ph 3-10 ampholinokat használunk a pH-gradiens kifejlesztésére, a fehérje izoelektromos pontja pH 6 * 1 pH-egységnek adódik. 4. példa Egerek immunizálása monoklónozott 25.77 ellen-186.00 5 10 15 20 25 30 35 4C 45 50 55 60 4
