186001. lajstromszámú szabadalom • Eljárás védőhatású protein-antigén előállítására
1 2 A találmány tárgya eljárás antigén anyag, valamint az antigént tartalmazó, malária elleni védettséget biztosító vakcinák előállítására. A malária kórokozói a Plasmodium nemzetségbe tartozó protozoonok. A protozoonok teljes életciklusának egy része a melegvérű gazdaszervezet vörosvértestjeiben végbemenő ivartalan szaporodásból áll, ebben a szakaszban jelentkeznek a malária tünetei. A melegvérű gazdaszervezetben a vérben szaporodó parazitákkal szemben védőhatásű immunválasz is kifejlődhet. Ez abból áll, hogy a vérben antigének keletkeznek, amelyek kiváltják a specifikus, védőhátás ellenanyag képződését a fertőzött vagy immunizált gazdaszervezetben. A vörösvértestekben végbemenő ivartalan szaporodási ciklus során a szabad paraziták (merozoiták) felismerik a vórösvértesteket, specifikusan tapadnak azok felületéhez, majd a plazma-membránon áthaladva elárasztják azokat. A fertőzött vörösvértest ne-, ve trofozoíta. A sejten belüli differenciálódás során a parazita sejtmagja ismételten osztódik, és kialakul a schizonta. A magosztódást a citoplazma osztódása követi, és kialakulnak az egymagú, vörösvértesten belüli morozöiták. A gazdaszervezet vörösvértest-membránja elroncsolódik, a merozoiták kiszabadulva a vérplazmába jutnak és újabb, friss vórösvértesteket támadhatnak meg és áraszthatnak el. Régóta feltételezték már, hogy a védőhatást kiváltó antigén(ek) a szabad merozoiták felületén helyezkednek el, mivel ebben a formában kerülhetnek csak közvetlen kapcsolatba az ellenanyag-tartalmú plazmával. Ezt támasztották alá Cohen, Butcher és Crandall (Nature 223, 368 /1969/) kísérletei is, akik kimutatták, hogy a Plasmodium knowlesi vörösvértestben végbemenő replikációs ciklusán in vitro gát-, lása akkor megy végbe, mikor a merozoiták szabaddá válva a specifikus ellenanyagot tartalmazó közegbe kerülnek. A szerzők szerint ebben a rendszerben az ellenanyag úgy hat, hogy a gazda vörösvértestekhez kötődve megköti a specifikus, merozoita felületi antigéneket. Később Mitchell, Butcher és Cohen (Immunology 29, 397 /1975/) tisztított, Freund-féle komplett adjuvánsba emulgeált merozoitákkal sikeresen vakcinálták P, knowlesi által okozott malária ellen a rhesus majmokat. Mivel várhatóan a malária paraziták elleni immunitás kialakulásának mechanizmusa alapvetően azonos rágcsálókban és főemlősökben, a főemlősök parazitái ellen talált ellenanyagok mellett a rágcsálók malária parazitái elleni ellenanyagokat is vizsgálták. Például a P. yoeüi elleni ellenanyag úgy tűnik, hogy a késői schizonták és/vagy a merozoiták ellen hat (Freeman és Parish, Experimental Parasitology52,18 /1981/), és két mcrozoitarspecikus monoklónozott ellenanyag is védőhatást mutatott, P. yoelii-vel fertőzött egerekbe injektálva (Freeman, Tredjdosiewicz és Cross, Nature 284, 366 /1980/, valamint Freeman, Holder, Tredjdosiewicz és Cross, The Host-Invader Interplay (H. Van den Bossche, szerkesztő) Elsevier/North Holland, 1980. 121-134. oldal) A merozoitákhoz kapcsolódó protein-antigénekben fellelhető különbségek meghatározására is folytak kísérletek (például Deans és munkatársai, Parasitology 77, 333 /1978/, Miller és munkatársai J. exp. Med. J51, 750 /1980/ és Kilejian, Proc. Nat. Acad. Sei. 77, 3695 /1980/). Azonban nem tudtak izolálni és jellemezni egyetlen olyan specifikus antigént sem, amely képes lett volna védőhatást kiváltani a gazdaszervezetben, vagy amelyet egy specifikus ellenanyag képes lett volna felismerni. A jelen találmány tárgya a Plasmodium paraziták merozoita alakjához kapcsolódó antigének izolálása és jellemzése. A találmány szerinti eljárással előállíthatok a Plasmodium nemzetségbe tartozó paraziták elleni védőhatást kiváltó protein-antigének - amelyekre jellemző, hogy . , (i) molekulasúlyuk 2,0.103 — 2,6 . 103 és (H) a paraziták vörösvértestekben levő merozoita alakjának meghatározott helyéhez kapcsolódnak —, valamint a fenti antigének funkcionális származékai. Molekulasúly alatt a poiiakrilamid gél-elektroforézissei, ismert molekulasúlyú referensanyagok jelenlétében mért molekulasúlyt értjük. A találmány szerinti eljárással előállított antigén-proteinek molekulasúlyának meghatározására alkalmas például a Laemmii, U. K. (Nature 227,680 /1970/) által leírt módszer. Ismert molekulasúlyú anyagként például spektrin heterodimert használunk. (A spektrin heterodimer a vörösvértest-membránban nagy mennyiségben található protein, melyet nyers preparátum formájában állítunk elő oly módon, hogy a vórösvértesteket Nonidet P40- nel szolubilizáljuk, centrifugáljuk, a fejülúszót elöntjük, majd a csapadékot dezoxikoláttal tovább szolubilizáljuk, és a maradék szilárd anyagot eltávolítjuk. A spektrin molekula az adott kísérleti körülmények között két .nem azonos ^alegységre válik szét, melyek 2,2 x 103 és 2,4 x 103 molekulasúlyú sávként jelennek meg.) A találmány szerinti eljárással előállított proteim -antigének közül különösen előnyösek a 2,35 . 103 molekulasúlyú antigének. A találmány szerinti eljárással előállított proteln-antigének ismerten több, maláriát okozó protozoonban - például a Plasmodium yoelii-ben, P, bergheiben, O. vinckei petteriben és P chabaudiban - előfordulnak, de megtalálhatók a főemlősök malária parazitáiban - különösen az emberi parazita P falciparumban - is. A leírásban használt kapcsolódó kifejezés nemcsak a parazitákból származó protein-antigén anyagra vonatkozik - amelyet a malária paraziták merozoita formájában nyerünk - hanem bármely más forrásból nyert, antigén tulajdonság szempontjából azonos, hasonló vagy azonos aminosav-szekvenciájtí anyagra is. A találmány szerinti eljárással előállított antigének a malária parazitákban csak a szaporodási ciklus késői szakaszaiban találhatók meg, vagyis elsősorban a .vörösvértesten belüli fejlődés során, amikor az egyes merozoiták kialakulnak. A találmány szerinti eljárással előállított antigének nem találhatók meg a gyűrű és a trofozoíta fejlődési szakaszokban. így például a P. falciparumban, amelynek a fejlődési ciklusa 48 órán át tart, nem találunk antigént a fejlődés első 30 órájában, viszont maximális antigén-szintézist tapasztalunk a fejlődési szakasz 36—45. órája közötti periódusban, amely nem esik egybe a teljes protein-szintézis 36. óra körül tapasztalható maximumával. A szakemberek számára nagy jelentőségű az a felfedezés, hogy minden fentebb definiált antigén-tulajdonságú protein — beleértve az antigén egyes fragmentumait és az antigént vagy annak egyes fragmen186.001 5 10 15 2C 25 30 35 40 45 50 55 60 2
