185928. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4-helyettesített 1-béta-D-ribofuranozil-1H-imidazo-[4,5-c] piridinek előállítására
1 185 928 2 hogy csökkentsük a reakcióidőt, mivel némely termék vizes oldatban nem stabilis. A használt enzimek tisztasági fokát célszerűségi szempontoktól tesszük függővé, ugyanis a nyers extraktumok bár katalizálják a kívánt reakciókat, de rendszerint a termék hozama rosszabb és elkülönítése is nehezebb - a fent ismertetett okok miatt-mint tisztított enzimek esetén. Amennyiben az enzimeket ammónium-szulfát szuszpenzióban tároljuk, előnyösebb, ha a szuszpenzió centrifugálásával kapott gömböcskéket adjuk a reakcióejegyhez, nem pedig az egész szuszpenziót. Az enzimeket a reakcióelegyből olyan módon nyerhetjük vissza, hogy miután a reakció egy megfelelő átalakulási fokot elér, például DEAE-cellulózra adszorbeáljuk, majd a reakcióelegy oldott komponenseitől centrifugálással vagy gélszűréssel különítjük el. Azokban az esetekben, amikor a termékek jelentős része kiválik a reakcióelegyből, az enzimeket ismét felhasználhatjuk olyan módon, hogy a termékeket elkülönítjük, és ismét kiindulási anyagot adunk a reakcióelegyhez az ismételt termékképzés céljából. Rendszerint előnyös, ha valamennyi komponens szuszpenzióban vagy oldatban van jelen, amennyiben azonban jól oldódó szubsztrátokat használunk előnyös lehet, hogy az enzimeket nem tartalmazó reakcióelegyet lassan oszlopon bocsátjuk át, melyek állófázisához a megfelelő enzimeket hozzákötöttük (például az enzimeket DEAE-cellulózra adszorbeáljuk). Tapasztalatunk szerint az enzimeket kívánt esetben tartósíthatjuk, így lehetővé téve hosszabb ideig- például 30 napig, vagy még tovább - tartó reakciókat is. Azonban azokban az esetekben, amikor az inkubáció 1 napnál hosszabb ideig tart, célszerű a reakcióelegyhez mikrobaellenes ágenst adni, például nátrium-, kálium-azidot vagy toluolt, kivéve ha a reakcióelegyet szűréssel vagy más ismert módszerrel sterilizáljuk. A kívánt purin-ribonukleozidokat bármilyen ismert módszerrel különíthetjük el. így például a kívánt végtermék és szennyezések különböző oldószerekben való oldékonysági különbsége, két oldószer közötti megoszlási koefficiensek különbsége, adszorbenshez - például ioncserélő gyantához - való adszorpció különbsége, keresztkötésű gyantán- például poliakrilamid gélen - történő eltérő vándorlási sebességek vagy oldószerből történő kristályosodási különbség alapján. Azokban az esetekben, amikor a termék kristályos formában kiválik a reakcióelegyből, centrifugálással vagy adott esetben szűrő használatával végzett szűréssel különíthetjük el. Az elkülönítési műveleteket a kívánt tisztasági foktól és a termékek állapotától függően egymással kombinálva vagy ismételve hajtjuk végre. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről, az oltalmi kör korlátozása nélkül. 1. példa 4-amino-1 -ß-D-ribofuranozil-1 H-imidazo[ 4,5-c] - piridin 2,4 mmól 4-amino-lH-imidazo[4,5-c]piridint, 7,2mmól uridint, 2,8 mmól K2HP04-t, 0,14 mmól kálium-azidot és 30 ml vizet tartalmazó szuszpenzió pH-ját kálium-hidroxiddal pH = 7-re állítjuk be, majd 1120 NE. purin-nukleozid-foszforilázt (melyet a 78 101 295,0 sz. európai szabadalmi bejelentés alapján állítunk elő) és Escherichia coli-ból Krenitsky módszerével (Biochim. Biophys. Acta, 429, 352-358 [1976]) előállított tisztított 156 NE.nyi uridin-foszforilázt adunk hozzá, és 37 °C-on 15 napon át tartjuk. Ezután a reakcióelegyet szűrjük, és 3 °C hőmérsékleten 48 000xg-vel 10 percen át centrifugáljuk, a kapott felülúszót Sephadex G-10 oszlopra visszük. A terméket tartalmazó frakciókat vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat alapján (vizet használunk) összegyűjtjük és vákuumban 40 ml térfogatra pároljuk be, majd 20 ml n-propanolt adunk hozzá. Hűtés után az oldatot poliakrilamiddal (P-2, Bio Rád Laboratories) töltött oszlopra visszük (5 x 90 cm-es) és 30%-os n-propanollal eluáljuk. 31 30%-os n-propanollal végzett eluálás után 50 ml telített 30%-os n-propanolos ammóniumhidrogénkarbonát oldattal, majd 30%-os n-propanollal eluálunk. A kapott terméket vákuumban szárítjuk, majd 5 ml vízben oldjuk és Sephadex G-10 oszlopra (2x90 cm-es) visszük, vízzel eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk, így a cím szerinti vegyület hemihidrátját kapjuk. A hozam 10%. Analízis: C11H14N404 • Vi H20 Elméleti: C 48,00; H 5,49; N 20,35; Talált: C 48,05; H 5,51; N 20,40; (%) UV spektrum (nm): max. min. váll. 0,1 n HC1 262 230 275 0,1 n NaOH 265,5 232 Vékonyrétegkromatográfiásan - cellulózlemezen vízzel - egységes. 2. példa 4-klór-l-f>-D-ribofuranozil-1 H-imidazof 4,5-cJ- piridin 23 mmól 4-klór-lH-imidazo[4,5-c]piridint, 27,4 mmól uridint, 11 mmól kálium-foszfátot, 123 ml vizet és 20 ml n-propanolt tartalmazó reakcióelegy pH-ját pH = 6,7-re állítjuk be, és 13 000 NE. purinnukleozid-foszforilázt (Id. 1. példa) és 1,100 NE. uridin-foszforilázt adunk hozzá. A szuszpenziót 11 napon át 37 °C hőmérsékleten tartjuk és 1000 NE. purin-nukleozid-foszforilázt és 100 NE. uridinfoszforilázt adunk hozzá. Ezután még 2 napon át 37 °C-on tartjuk, majd szűrjük és a szűrletet rotavapor készüléken eredeti térfogatára vonatkoztatottan felére bepároljuk, és Sephadex G-10 oszlopra (5 x 90 cm-es) visszük, vízzel eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és 10 ml térfogatra pároljuk be vákuumban, majd poliakrilamiddal (P-2, Bio Rád Laboratories) töltött oszlopra (2,5 x 90 cm-es) visszük. 30%-os n-propanollal végzett eluálás után a terméket tartalmazó nem sárga 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
