185798. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4-hidroxi- 1,2-benzizotiazol 3(2H)-on- 1,1-dioxid-származékok és sóik előállítására
1 185 798 2 Vizsgálat patkányokon: 10 hím és 10 nőstény Chbb: THOM patkányt vetettünk alá a vizsgálatnak. 5 héten át az állatok naponta 750 mg/kg B anyagot kaptak. A vizsgálati idő alatt az állatok feltűnésmentesen viselkedtek. Spontán elhullások nem fordultak elő. Az 5 hét kezelés eltelte után az állatokat leöltük, és a szívet, tüdőt, májat, lépet, mellékveséket, agyat, vesét és hasnyálmirigyet szövettani vizsgálatra kipreparáltuk. Ezen szervek szövettani vizsgálata semmiféle olyan patologikus leletet nem eredményezett, amely az anyag beadásával összefüggésbe hozható lett volna. Vizsgálat kutyákon: 3-3 hím és nőstény Beagle-kutyát vontunk be a vizsgálatba. Ezek az állatok ugyancsak 5 hetes időtartamon át kapták a B anyagot szájon át 750 mg/kg dózisban. Az általános észlelésben semmilyen zavart nem figyeltünk meg. Spontán elhullások nem fordultak elő. Az alkalmazott 5 hetes megfigyelési idő eltelte után az állatokat leöltük, és a patkányoknál már felsorolt szerveket szövettani vizsgálatra kipreparáltuk. Az említett szerveken semmiféle olyan lelet nem volt észlelhető, amely az anyag adagolásával kapcsolatba hozható lett volna. 3. Mutagén hatás vizsgálata Egy édesítőszerrel szembeni legfontosabb követelmény ezen anyag egészségi szempontból közömbös volta. Ennek a követelménynek azonban a legtöbb édesítőszer nem tesz eleget. így például a szacharin mutagén hatást mutat [R. P. Batzinger, S.-Y. L. On és E. Bueding; Science 198, 944 (1977)], ami édesítőszerként való alkalmazhatóságát kérdésessé teszi. A B anyagot AMES-rendszerben [Mutation Research 31, 347-364 (1975)] mutagén tulajdonságaira megvizsgáltuk. Azon célból, hogy az indukált molekuláris DNS-károsodások (bázis-szubsztitúciók, részlet-eltolódás mutációk, törlések) teljes spektrumát kimutathassuk, genetikai indikátorokként a Salmonella typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1537 és TA 1538 auxotrof baktériumtörzseket alkalmaztuk. Minden baktérium részére úgy építettük fel a teszteket, hogy egy megfelelő kofaktorokkal rendelkező mikroszomális enzimrendszer befolyása a vizsgálandó anyagra és az enzimindukcióban lévő eltérések vizsgálhatók voltak. A tesztelés aktiváló rendszer hozzáadásával és anélkül történt. Az in vitro aktiválásra normális, azaz előzetesen nem kezelt patkányok és Aroclor 1254-gyel (500 mg/kg) indukált patkányok S-9 kiugrásait (az endoplazmatikus retikulum töredékei) használtuk. Az indukált S-9 frakcióból 3 különböző koncentrációfokozatot vizsgáltunk. Az anyag koncentrációja lemezenként 0,25; 2,5; 5 és 10 mg volt. Egy előzetes sorozathigítási vizsgálatban a legmagasabb adag még semmilyen gátlást nem mutatott a sejtnövekedésre. A vizsgált törzsek egyikének esetében sem okozott a B anyag spontán mutáció-gyakoriság növekedést. Az enzimindukciónak és az aktiválási frakciónak a visszamutálásokra való befolyása nem volt kimutatható. A megszámolt telepek a lapokon a mindenkori vizsgálatok spontán tartományain belül voltak. A kísérletek azt mutatták ki, hogy a B anyag semmilyen bázisszubsztitúciót [S. typhimurium TA 1535, TA 100] és semmilyen részlet-eltolódási mutációt [S. typhimurium TA 1537, TA 1538, TA 98] nem vált ki, és így semmilyen jel nem mutat a B anyag esetleges mutagén voltára. A következő példák az édesítőszerek előállítását szemléltetik: 1. példa 4-Hidroxi-l ,2-benzizotiazol-3(2H)-on-l ,1-dioxid 5 g (25,2 mmól) 3-amino-4-hidroxi-l,2-benzizotiazol-l,l-dioxidot és 2,02 g (50,5 mmól) nátriumhidroxidot 15 ml vízben 6,5 órát forralunk visszafolyó hűtő alatt. Utána az oldatot 60 °C-on aktív szénnel derítjük, és szűrjük. A szűrletet 60 °C-on tömény vizes sósavoldattal (körülbelül 5 ml, körülbelül 0,06 mól) megsavanyítjuk. A keletkezett csapadékot kiszűrjük, megszárítjuk, és vízből átkristályosítjuk. így 4,62 g (az elméleti 92%-a) 4-hidroxi-1,2-benzizotiazol-3(2H)-on-l,l-dioxidot kapunk, amelynek olvadáspontja 228 °C. Az infravörös spektrum jellemző adatai (diklórmetánban): 3320 (NH, OH asszoc.); 1720 (CO); 1335 és 1140 cm-1 (S02). A tömegspektrum adatai: 199 (M+), 136, 119 és 108 m/e. Az elemanalízis eredményei a C7H5N04S (199,19) összegképletre: számított: C% 42,20; H% 2,53; N% 7,03; S°„ 16,10; mért: C% 42,23; H% 2,60; N% 6,97; S°0 16,10. A 3-amino-4-hidroxi-1,2-benzizotiazol-1,1-dioxid kiindulási anyagot a következő módon állítottuk elő 2-nitro-6-metoxi-benzonitrilből kiindulva [A. Russel and W. G. Tebbens, Org. Synthesis, Coll. Vol. III, 293. old.]: 2-Amino-6~metoxi-benzonitril 10 g (56,1 mmól) 2-nitro-6-metoxi-benzonitrilt, 26,6 g (220 mmól) ónt és 12,7 g (56,1 mmól) ón(II)kloridot 160 ml 1 : 1 arányban hígított tömény sósavoldatban 1,5 órán át forralunk visszafolyó hűtő alatt. Utána a reakcióelegyet 60 °C-ra lehűtjük, és ezen a hőmérsékleten 40 g nátrium-hidroxid 10 ml vízzel készült oldatát csepegtetjük hozzá. A nátrium-hidroxid oldat egész mennyiségének hozzáadása után (pH körülbelül 4) a pH-t nátrium-karbonát adagolásával 9-re állítjuk, és a keletkező csapadékot kiszűrjük. A szűrőn maradó anyagot 200 ml etanollal 20 percig forraljuk visszafolyó hűtő alatt, majd szűrjük. A szűrletet bepároljuk, így 9 g nyersterméket kapunk. Az ón-hidroxid és a termék keve5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
