185784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növények tartósítására takarmányozás céljaira
1 185 784 . 2 és a hemicellulolitikus komplex között szinergizmus áll fenn. A növényben lévő cellulóz hidrolíziséhez több enzim szükséges, vagy pedig egy, amely több feladatot lát el, melyek a következők :- az amorf zónák hidrolízise,- kristályos területek felduzzasztása és a hidrogénkötések felhasítása abból ä célból, hogy lineáris molekulákhoz jussunk,- a cellobióz hidrolízise glükózzá,- a di- és az oligoszacharidok transzglükozilálása, valamint a cellulóz és primer hidrolízis termékei szabálytalan kötéseinek felhasítása. A cellulolitikus komplexet úgy választjuk meg, hogy a fenti kritériumoknak megfeleljenek különböző növényekkel végzett nagy számú vizsgálat alapján. A cellulázt aktivitásával határozzuk meg: 1 g termékre jutó hatást nemzetközi egységekben (NE) fejezzük ki, 1 NE az az enzimmennyiség, amely redukáló cukorból 1 mikronról glükózzal egyenértékűt szabadít fel percenként az adott cellulóztartalmú szubsztrátumból. Az aktivitás az alkalmazott szubsztrátumok függvényében változik:- ha az aktivitást Wathman CC 31 papir-poron vizsgáljuk, akkor az aktivitás Q;- ha az aktivitást karboxi-metil-cellulózon vizsgáljuk, akkor Cx az aktivitás. A találmány szerinti komplexnek mind a cellulolitikus aktivitása, mind pedig a hemicellulolitikus szekunder aktivitása igen nagy. Az erőteljes cellulolitikus hatás az igen erős C, és a Cx, valamint a cellobiáz (ß-glükozidäz) aktivitásban fejeződik ki. A Q enzimes komplex hatása, ami a hipotézisek szerint a Cx aktivitásból és egy ismeretlen faktorból áll, amit a cellulózbontó képességével határozunk meg. C, a natív cellulózt (kristályos cellulóz, amelynek polimerizációs foka PF > 3500 glükóz egység) képes lebontani amorf cellulózzá. A Cx enzimes komplex hatása elsősorban abban nyilvánul meg, hogy az endo- és exoglukanázokat redukálni képes. Ezek az enzimek főleg a cellulózfibrillumokra hatnak a gyengén kristályos zónákban, és a hosszú glükóz láncokat kisebb egységekre hasítják. A ß-glükozidäz aktivitása a Cx hatása után a cellobióz egységekre gyakorolt hatásban nyilvánul meg. A különböző hatásokat nem lehet külön értékelni. A C, és Cx között szinergizmus áll fenn a homopolimerek lebontásában. A Q és Cx enzimes mechanizmusa a cellobióz termeléséhez vezet; ezt követi a ß-glükozidäz hidrolízise, aminek eredménye két egység glükóz. A cellulóz hidrolízis reakciói az alábbi séma szerint végzik a bontást : C natív cellulóz reaktív cellulóz , , „ Cx hidrolitilus „ reaktív cellulóz-------------------> cellobioz „ ... hidrolitikus ß-glükozidäzv „ ... cellobioz----------------------------------* 2 molekula glükóz. A Cj komplex szolubilizálja a kristályos cellulózt [polimerizációs fok (PF) több mint 3500 glükóz monomer] és reaktiv cellulózt (amorf cellulózt) termel. A Cx enzimes komplex (endo- és exoglükanázok) hatására a reaktív cellulóz láncai lehasadnak, akár a belsejében és véletlenszerűen az endoglükanázok esetében, akár a nemredukáló szélső helyekből kiindulva az exoglükanázok esetében. Az összes reakció együtt cellobióz egységeket eredményez. Ezeket a cellobióz egységeket egy ß-glükozidäz hidrolizálja, és így két molekula glükóz keletkezik. A találmány szerinti megoldásnál a gomba eredetű cellulázok esetében a C, és Cx enzimes komplex az oldhatatlan natív cellulózt képes glükózzá hidrolizálni. A cellulázokat a találmány szerint nemcsak a fenti általános kritériumok alapján választjuk ki, hanem - figyelembe véve a silózás különleges közegét is - a cellulázok poliszacharidokat bontó hatása alapján. Ezt a poliszacharidokat bontó hatást kétféle típusú szubsztrátumon (növényen) határozzuk meg : a) - tiszta szubsztrátumon; b) - dehidratált szubsztrátumon. A TISZTA SZUBSZTRÁTUM VIZSGÁLATA: Meghatározzuk az A, B, C, D, E, F cellulázok aktivitását különféle szubsztrátumokon, adott koncentrációnál 10“4 mól acetát-puffer-közegben. Az aktivitást a szokásos előírások szerint vizsgáljuk, vagyis pH 4,8-nál, 50 °C-nál, 20 perces hidrolízis után. A redukálóképességet hexaciano-ferrát(II)-os módszerrel határozzuk meg. \ Szabszt\ rátum \ (kon- Nxmtrá\ ció) Enzim (aktivitás) Wathman papir Karboxi-metil-cellulóz Pektin Xilán Arabino-galaktán Keményítő Locus bean 1% 0,25% 0,25% 0,10% 0,25% 0,25% NE/g (C,) NE/g (cx) NE/g NE/g NE/g NE/g NE/g A 400 6444 356 511 22 394 544 B 211 5660 322 611 33 100 300 C 266 1999 411 311 0 244 389 D 52 6440 255 511 0 120 132 E 372 8500 305 605 0 0 0 F 960 7666 1030 1200 0 0 140 A DEHIDRATÁLT SZUBSZTRÁTUM VIZSGÁLATA: Az A, B, C, D, E, F enzimek aktivitását határozzuk meg különféle dehidratált takarmányon. Az aktivitást pH 3,8-4,8-5,8 intervallumban vizsgáljuk 30 °C-on, 24 órás hidrolízis után. A redukálóképességet a dinitro-szalicilsavas módszerrel határozzuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
