185701. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyarozs alkaloidok, főként béta-ergokriptin parazita úton való előállítására
I . 85 701 2 A találmány tárgya eljárás ? lyarozs alkaloidok, főként béta-ergokriptin parazita úton való előállítására, claviceps purpurea törzs új variánsával. A korábbiakban az ergokriptint és ergokornint. kizárólag szaprofita úton állították elő. E szerint a szaprofita Claviceps purpurea törzs folyadékkultúrában, speciális táptalajon a szükséges feltételek biztosítása mellett ergokriptint és ergokornint termel (164 816 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás és a T/20 619 teljes vizsgálati közzététel). Parazita körülmények között, főleg béta-ergokriptint termelő Claviceps purpurea törzs eddig nem létezett. Ismeretes viszont olyan parazita anyarozs törzs, melynek spóráival fertőzött rozson képződött szklerócium alfa- és béta-ergokriptint, ergokornint és ergozint együttesen termel, amelynek intézeti jelzése BkVe/169(12). A találmány célkitűzése olyan eljárás kidolgozása a béta-ergokriptin parazita úton való előállítására, amelyben a parazita Claviceps purpurea törzs új variánsa- mesterséges táptalajon, agar felületen és süllyesztett tenyészetben jól spórázik,- spórái jól tartósíthatok,- spórái életképesek és virulensek, újra tápközegbe juttatva 90-95%-ban csíráznak és a rozsra juttatva azt fertőzik,- magas droghozamot biztosít,- a drog főalkaloidként 90 —95%-ban bétaergokriptint tartalmaz. Az új törzs előállítását a mutációt előidéző sugárkezelés, valamint az ivaros és szelekciós nemesítési mód alkalmazásával végeztük. A béta-ergokriptint tartalmazó vegyes alkaloid tartalmú törzset, amelynek intézeti jelzése BkVe/169(12) 1981. november 9-én az Országos Közegészségügyi Intézetben 00217 szám alatt deponáltuk. A béta-ergokriptint tartalmazó vegyes alkaloidtartalmú törzs droganyagából küllemileg megfelelő, simafelületü, nagyméretű szkleróciumokat választottunk ki. Ezeket a szkleróciumokat 1200- 1500 Gray dózisú rádioaktív gamma-sugárzásnak vetettük alá, amely sugárdózist 12-15 óra alatt folyamatosan juttattuk a szkleróciumokhoz. A kezelt szkleróciumból steril darabkákat oltottunk 10%-os maláta-agar táptalajra. A Ietális dózis körüli sugármennyiséget túlélt szkleróciumokból létesített tenyészeteket maláta-kivonatot, szaharózt és Stoll féle tápsókat tartalmazó táptalajra oltva, 6 napos tenyésztés után újabb 500 - 800 Gray dózissal sugárkezeltük. A kezelt spóratömeget maláta-agar felületre szélesztettük. Kiválasztottuk és izoláltuk az eltérő morfológiájú telepeket, felszaporítás után spóráikat izoláltan rozskalászra oltottuk. Minden kifejlődött szklerócium felét vékonyrétegkromatográfiás módszerrel analizáltuk. A több száz szklerócium vizsgálata során találtunk néhány mutáns egyedet, amely béta-ergokriptint tartalmazott, lényegében alfa-ergokriptintől mentesen. Kísérő alkaloidként alfa-ergokriptint és ergozint találtunk. A főleg béta-e/gokriptint tartalmazó szkleróciumokat az alkaloidszint javítása céljából ivaros nemesítési folyamatnak vetettük alá. E célból a kiválasztott szkleróciumokat nedves homokba ágyaztuk és 6 hétig 0 — 5 °C-on tartottuk, majd a felületet steril vízzel lemosva Petri-csészében nedvesen tartott steril szivacsra helyeztük. A sztrómák kialakulása és kifejlődése után kiválasztottuk a megfelelő méretű és fejlettségű sztrómákat, amelyeket höráhatással az aszkospórák kilövellésére résztettünk. Az aszkospórákat 10 %-os malátaagir táptalajon steril körülmények között tenyészte iük. Az így kialakult telepek spóráit felszaporítva izolált parazita körülmények közé helyeztük, rozsnövények oltótüs fertőzésével. Az izolációt 20 m-es rozssáv biztosította. A kifejlődött szkleróciumokat a vékonyrétegkromatográfiás analitikai vizsgálatok alapján szelektáltuk. A szelekciós nemesítési munkát további 2 éven át folytattuk. Az új törzsei, amelynek intézeti jelzése Bk6/263/ 1981, 1981. november 9-én az Országos Közegészségügyi Intézetben a 00218 szám alatt deponáltuk. Az új törzs a kiindulási tenyészethez képest a spórafermentációban és a drogtermesztésben az alábbi eredményeket adta: Új törzs Régi törzs Intézeti jelzése Bk6/263( 1981 ) BkVe/169(12) OKI deponálási száma 00218 00217 OKI deponálási ideje 1981. nov. 9. 1981. nov. 9. Formende spóraszáma (spóra/mmJ) 4-5- 105 1-2 10s Tartósított ollóspora csiraképességc % 95-98 80-90 Virulencia % 80-90 60-65 Ezcrszkleróciumlömeg (g) 185 120 Terméseredmény (kg/ha) 250-300 100-150 Béta-ergokriptin hozam (kg/ha) 0.687 0.063 Mellékalkaloidok 5- !0“„ alfa-ergokriplin nyom ergozin ergokornin alfa-ergokriptin ergozin Zsírolajtartalom % 20 22 A találmány szerinti eljárást közelebbről az aláb bi példák szemléltetik: i 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
