185668. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulinok B-30 helyzetű aminosavjának enzimatikus helyettesítésére
1 185668 2 A 3. ábra a sertés inzulin és a treonin-amid reakciótermékének ioncserélő kromatográfiás elúciós profilját mutatja. (Az ábra magyarázata a 4. példánál található.) 1. példa Sertés inzulint karboxipeptidáz Y-nal inkubálunk 25 °C-on, pH 5—7 értéken (az enzim ebben a pH-tartományban maximális peptidáz aktivitást mutat). A B-lánc C-terminális végéről a következő aminosavak válnak szabaddá: 1,0 alanin, 1,0 lizin, 1,0 prolin, 1,0 treonin, 1,0 tirozin és 2,0 fenilalanin. A B—23 helyzetnél (glicin) a karboxipeptidáz megáll, így az inzulin B-lánc első hét aminosavjának tökéletes szabaddá válását érjük el. Meglepő módon az A-lánc C-terminális aszparaginja (A—21) egyáltalán nem válik szabaddá. A B-lánc C-terminális alaninja pH 9,5 értéknél sokkal gyorsabban válik szabaddá, mint a következő aminosavak. Fontos megjegyezni, hogy a Leu-Tyr (B—15— B—16) kötés nem hasad el, mivel a használt tisztított CPD—Y enzim proteáz A-tól (endopeptidáz) mentes, ellentétben sok kereskedelemben kapható, más forrásokból nyert enzimmel. 2. példa Ebben a példában bemutatjuk a sertés inzulin emberi inzulinná alakítását, amin-komponensként treonin-amidot használva, az inzulin-amid köztitermék izolálása nélkül. Cink-mentes sertés inzulin (2 mmól/l-es) 10 mmól/1 EDTA-t és 0,5 mól/1 L-treonin-amidot tartalmazó 0,1 mól/l KCl-os oldatához, pH 9,5-ön és 25 °C-on 50 pmól/1 karboxipeptidáz-Y-t adunk. A reakció pH-ját 0,5 mól/1 NaOH adagolásával állandó értéken tartjuk, az adagolást pH-sztáttal végezzük. A reakció lefolyásának követésére különböző időpontokban alikvotokat veszünk a reakcióelegyből, 6 mól/l-es HC1- val a pH-t 1—2-re állítva a reakciót leállítjuk. A mintát ezután 1 mól/1 ecetsavval ekvilibrált Sephadex G—50-en (1 x 30 cm) kromatografáljuk, ezáltal az inzulint az enzimtől és a szabad aminosavaktól elválasztjuk. Az inzulin-tartalmú frakciókat liofilizáljuk, majd az aminosav-összetételt a fentebb leírt módon meghatározzuk. A reakció lefolyását az 1. ábra mutatja. Az aminosav-analízis eredményekből kiszámítottuk, hogy a treonin tartalom 1 mól inzulinra számítva 0,7 móllal növekedett, míg az alanin tartalom 0,8 móllal, a lizin tartalom 0,2 móllal csökkent. Az eredményekből kitűnik, hogy 6,5 óra reakcióidő után a sertés inzulin 20%-a változatlan, míg az inzulin 20%-ában az alanin mellett a következő aminosav, a lizin is szabaddá vált. A 0,8 mól alanin szabaddá válását 0,7 mól treonin beépülése kíséri. A reakciótermékeket tovább analizáltuk karboxipeptidáz A enzimes emésztéssel. A karboxipeptidáz A csak a szabad karboxilcsoportot tartalmazó aminosavakat hidrolizálja, és nem teszi szabaddá a lizint. A fenti specificitással összhangban, a sertés inzulin karboxipeptidáz A-val végzett emésztése során a B-lánc C-terminálisáról csak az alanin, az A-lánc C-terminálisáról csak az aszparagin válik szabaddá. Ezért a 6,5 órás reakció után vett inzulin mintát inkubálva az aszparagin mellett csak az átalakulatlan sertés inzulinnak megfelelő mennyiségben fog alanin szabaddá válni. Meglepő módon az alanin mellett treonin is szabaddá vált, a humán inzulin-amid köztiterméket képező beépült treonin-amiddal ekvivalens mennyiségben. Ez annak tulajdonítható, hogy a karboxipeptidáz Y peptidáz és észteráz aktivitása mellett peptid-amid-hidroláz aktivitással is rendelkezik [Breddam és munkatársai, Carlsberg Res. Comm. 45, 237 (1980)]. Nyilvánvalóan a sertés inzulin karboxipeptidáz Y jelenlétében végbemenő reakciója során a C-terminális alanin először treonin-amiddal kicserélődik, transzpeptidációs reakcióban, emberi inzulin-amidot adva, melyet aztán a karboxipeptidáz Y hidrolizái, a reakció eredménye mintegy 60% emberi inzulin, 20% átalakulatlan sertés inzulin és 20% egyéb hidrolízistermék. A reakció fenti sorrendben történő lefolyását más kísérletek is megerősítik. Kevesebb enzimet vagy rövidebb reakcióidőt alkalmazva a reakciótermékek a karboxipeptidáz A- val végzett emésztésének eredménye kisebb treonin felszabadítást mutatott, a treonin beépüléssel összehasonlítva, vagyis az emberi inzulin-amid képződés került túlsúlyba. A reakció termékek elválasztására a 6,5 órás reakcióban kapott mintát nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel tisztítjuk. „Lichrosorb RP—18” 5 pm-es, fordított fázisú oszlopot (0,4 x 30 cm), „Waters Model 6000 A” szivattyút és 220 nm hullámhosszon működő „Model 450” UV-detektort használva. Eluensként 28,75% metil-nitril [5 mmól/1 n-butil-náírium-szulfonátot és 50 mmól/1 nátrium-szulfátot tartalmazó 5 mmól/l-es tartarát pufferben (pH 3,0)] oldí tot használunk [Inouye és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 101, 751 (1979)]. Az átfolyási sebesség 1,0 ml/perc. Ebben a rendszerben a sertés és az emberi inzulint nem lehet elválasztani, de az összes többi melléktermék elválasztható. A kromatografált anyag aminosav-analízise az I. táblázatban látható. Az analízis jó egyezést mutat az elméletileg várható értékekkel. A 2,6 mól treonin és 1,3 mól alanin tartalom arra utal, hogy a minta mintegy 70% emberi és 30% sertés inzulint tartalmaz. I. táblázat Inzulin aminosav-összetétele . . mól aminosav/mól Sorrend Aszparaginsav 3,1 3 3 Treonin 2,6 2 3 Szeri n 3,1 3 3 Glutaminsav 7,2 7 7 Prolin 1,2 1 1 Glicin 4,0 4 4 Alanin 1,3 2 1 Valin 3,5* 4 4 Izoleucin 1,4* 2 2 Leucin 6,1 ’ 6 6 Tirozin 3,6 4 4 Fenilalanin 3,0 3 3 Hiszíidin 1,9 2 2 Lizin 1,0 1 1 Arginin 1,0 1 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
