185668. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulinok B-30 helyzetű aminosavjának enzimatikus helyettesítésére
185 66 a 3. példa Ebben a példában a sertés inzulin emberi inzulinná alakítását mutatjuk be, amin-komponensként treo nin-metil-észtert alkalmazva, a köztiíermékek elválasztása nélkül. 8 mmóJ/1 cink-mentes sertés inzulin oldathoz (IC mmól/1 EDTÁ-t és 0,5 mól L-treonin-metil-észter: tartalmazó 0,1 mói/l-es KCl-oldatban oldva) pH 9,5 értéken és 25 °C-on 60 umől/'l karboxipeptidáz Y- adunk. A reakcióelegy pH-ját 0,5 mól/1 NaOH adagolással állandó értéken tartjuk, az adagolást pH- sztáttal végezzük. A reakció lefolyásának követésére z. reakcióelegyből különböző időpontokban alikvotoka: veszünk, és 6 mól/l-es HCl-vaí a pH-t l-~2-re állítva z reakciót leállítjuk. A mintát ezután í möl/1 eceisavva ekvilibrált Seph&dex8- G—50-en (1 x 30 cm) fcroma tografáljuk, ezáltal az inzulint a szabad amínosavak tói és az enzimtől elválasztjuk. Az inzulin tartalmi frakciókat liofilizáljuk, az aminosav-összetételt a fen tebb leírtak szerint meghatározzuk. A reakció lefolyását a 2. ábrán mutatjuk be. A reakció lefolyása nagyon hasonló a fentebb leírt, amin komponensként treonin-amidot tartalmazó reakció lefolyásához: a treonin beépülését az alanin és csekély mennyiségű lián felszabadulása kíséri. A 17 órás reakcióidő eltelte után vett minta karboxipeptidáz A-vai végzett emésztése alanin és treonin felszabadulásé! eredményezte, ebből arra következtettünk, hogy a B- lánc C-terminális alaninja először a treomn-metil-észterre! kicserélődve emberi inzuiin-monometil-észterí aa, ami ezt követően a karboxipeptidáz Y hatására emberi inzulinná hldrolizálódik. Noha a reakció minőségileg hasonló az előző példában leírt, treonínamiddal végzett reakcióhoz, a végső reakcióelegy csak 40% emberi inzulint tartalmaz 40% áíaiakuiatian sertés inzulin és 20% egyéb hidrolízistermék mellett. 4. példa Ebben, a példában a sertés inzulin emberi inzulinná ^»írását mutatjuk be, aimn-komponensként írso. ...-aaudot alkalmazva, az mzuiin-aaiid közutermék elválasztásával, 2 mmól/1 cink-mentes sertés inzulin oldathoz ?2 mmól/1 EDTA-ban, 0,1 mól/1 KCl-ban és 0,5 mól/1 treonin-amidot (L-Thr-NH2) tartalmazó 1,5 mól/1 guanidin-bidrokloridban oldva] pH 7,5 értéken 25 °C-on 15 mmó!/ karboxipeptidáz Y-t adunk, A reakcióelegy pH-ját 0,5 rnói/i NaOH adagolásával pH- szí át segítségével állandó értéken tartjuk, A reakció lefolyásának követésére a reakcióelegyből különböző időpontokban alikvotokat veszünk, A reakciót 2 óra elteltével leállítjuk, a pH-t 1,5—2,0 értékre állítva 1 mól/1 HCl-val. Az inzulin tartalmú frakciókat az enzimtől és az alacsony molekulasúlyú vegyüietektől 1 mói/1 ecetsavval ekvilibrált ,vSephadexR G—50 fine” töltetű oszlopon (1 x 30 cm) végzett kromatográfiával választjuk eí, majd liofii-záJjuk. A iiofilizáit inzulin aminosavösszetételének meghatározása arra enged következtetni, hogy a sertés inzulin 78%-a átalakult a reakcióban. Az inzulinban jelenlévő reagensek további analízise céljából az inzulint DEAJ3-SephadexR A—25 töltetű oszlopon ioncserélő kromatográfiának vetjük alá, Morihara és munkatársai [Nature 280, 412 (1979)] módszere szerint. 75 mg Iiofilizáit inzulin mintát 0,01 mól/1 Tris puffert, 2,5 môl/1 karbamidot és 0,05 mól/1 NaCl-ot tartalmazó oldatban oldunk, pH 7,5- ön és egy DEAE-SephadexR A—25 töltettel ellátott (azonos összetételű pufferte! ekvilibrált) oszlopra (2,5x25 cm) visszük. Az inzulint 0,05—0,30 mói/1 NaCl gradienssel (azonos pufferben oldva) eluáljuk, SephadexR G—25 oszlopon 8 ml-es frakciókat gyűjtünk és liofilizáljuk. Az eiúciós profil a 3. ábrán látható. Három csúcsot figyelhetünk meg. Meghatároztuk az egyes csúcsok aminosav-összetételét, yalamint a CPD—Y-na! és CPD—A-val fentebb leírt módon végzett emésztések eredményeként kapott csúcsok aminosav-összetéíeíét is. Mivel ezekben a reakciókban csak az inzulin B ián: cának C-terminális aminosavja vesz részt, a sertés inzulin jelölésére -Pro-Lys-Ala-OH rövidítést alkalmaztunk, Ennek megfelelően a többi inzulint az alábbiak szerint rövidítjük: -Pro-Lys-Thr-OH — emberi inzulin, -Pro-Lys-Thr-NH2 — emberi inzulin-amid és így tovább. A kiindulási inzulin és az egyes csúcsok aminosav-összetétele a következő: Aminosav Kiindulási inzulin I. csúcs II. csúcs Hl. csúcs Treonin 2,55 3,65 2,52 2,50 Alanin 1,22 1,09 1,52 1,02 Lizin 0,55 0,99 0,74 0,06 Terület (%) 21 61 18 Az egyes csúcsok összetétele a következő : 3. csúcs: 65% -Pro-Lys-Thr-Thr-NH2 35% -Pro-Lys-Thr-NKj ü. csúcs: 52% -Pro-Lvs-Ala-OH 26% -Pro-Lys-Thr-OH 22% -Pro-Thr-NHj Hl. csúcs: bomlási termékek Látható, hogy a reakció lefolytatásához használt pH 7,5 értéken, ahol a CPD—Y amidáz aktivitása általában alacsonyabb a pepiidáz aktivitásánál, a képződött peptid-amid eléggé stabil, mivel az Ï. csúcs a teljes inzulin tartalomnak körülbelül 20%-át tartalmazza. A reakció során a sertés inzulinnak mintegy 75%-a átalakul. Azonban mivel az L csúcs treonin tartalma (3,65) magasabb, mint az emberi inzulinban mért tartalom (3,0) nyilvánvaló, hogy a kezdeti transzpeptitíációs termék (-Pro-Lys-7hr-NH2) nem eléggé stabil, így egy oligomer képződés (-Pro-Lys- Thr-Thr-NH2 keletkezése) is végbemegy. A? amid köztitermékek elegyének a fentiek szerinti képződése alapján arra következtethetnénk, hogy a korábbiakban leírt, CPD—Y-nai végbemenő dezamidálás során nem keletkezhet tiszta emberi inzulin, mivel a dezamidáció eredménye várhatóan egy -Pro-Lys- Thr-OH-ból és -Pro-Lys-Thr-Thr-OH-ból álló elegy lesz, Azonban ha az I. csúcsnak megfelelő frakciókat dezamidálásnak vetjük alá, 10 pmól/í CPD—Y-enzimme!, pH 10,0 értéken, 0,1 mól/1 HCl-at és 2 8
