185660. lajstromszámú szabadalom • Eljárás májsejtek szaporodását stimuláló faktor előállítására
1 185660 2 À következőkben az extraktum előállítását írjuk le. A példában a májuktól részben megfosztott kísérleti állatok Peyer-féle mirigyeiből való extrahálást ismertetjük. Példa A kísérleteket 95—105 g súlyú nőstény SPF-Wistarpatkányokon (Institut für Strahlen- und Umweltforschung, Neuherberg/München) végeztük. Az állatokat leöltük, kivéreztettük és a Peyer-féle mirigyeket mikrosebészetileg eltávolítottuk. Ezután a Peyer-féle mirigyeket 4-szeres (súly) mennyiségű, kétszer desztillált vízzel egy Elvehjem—Potter homogenizátorban homogenizáltuk. Ekkor a Peyer-féle mirigyek sejtanyaga felaprítódott és a lehető legteljesebben elroncsolódott. Az említett készülék ismert; a sejtek ebben egy üveghengerben eközött és egy ebben forgó teflonrúd között őrlődnek. A sejtekben lévő anyagok igy a következő koncentrálási, illetve elválasztási műveletekhez hozzáférhetők lesznek. Ezt a Peyer-féle mirigyekből kinyert sejthomogenizátumot 0,1 n sósavoldattal a megadott pH-értékre állítjuk. Ez a savanyítás fontos elválasztási módszer nagyszámú protein kicsapására: ezek kiválnak, és ezzel a további koncentrálási, illetve elkülönítési eljárásból kimaradnak. Lényegében tehát olyan proteinek maradnak a homogenizátumban, amelyek pH 5,5-re való savanyításkor még stabilak. Azaz ezek pH s£5,5 numerikus értéknél stabilak (mivel egy numerikusán kisebb pH-érték erősebb savanyításnak felel meg). Utána a homogenizátumot 95 °C hőmérsékleten 20 perc időtartamig hődenaturáljuk. Ennek az a célja, hogy további alkotórészeket csapjunk ki, nevezetesen olyanokat, amelyek ezen vagy magasabb hőmérsékleten nem állandók. Ezzel a két eljárási lépéssel (pH 5,5-re való savanyítás és 95 °C-on való hődenaturálás) tehát a homogenizátum alkotórészeinek nagyrészét elhasítjuk és így kicsapjuk. Ezután 15 perc időtartamú centrifugálás következik 4000 g-vel (Minifuge Christ, Osterrode/Harz). A centrifugálás utáni felülúszó így csak azokat az eredeti homogenizátumban jelenlévő hatóanyagokat tartalmazza, amelyek pH 5,5-nél és 95 °C- on még stabilak, ezeket viszont tisztított formában. Azon célból, hogy ezen hatóanyagoknak még azt a részét is kinyerjük, amelyek még abban a csapadékban vannak, amelyet a centrifugálásnál kaptunk, ezt a csapadékot kétszer desztillált vízzel ismét feltöltjük az eredeti térfogatra, újból pH 5,5-re savanyítjuk, és 95 °C-on hődenaturálásnak vetjük alá, és centrifugáljuk. Ezt a műveletet összesen kétszer ismételjük. Az összesen három centrifugálási műveletből származó felülúszókat egyesítjük, és liofilizáljuk, azaz vákuumban vízelvonás közben fagyasztva szárítjuk. Az anyag ezután porszerű formában áll rendelkezésre, és —20 °C-on tároljuk. Ez az anyag a következőkben leírt kísérleteknél használt extraktum (TH-extraktum). Egyidejűleg ugyanilyen módon készítünk extraktumot olyan állatokból is, amelyeknek nem távolitottuk el részlegesen a májukat. Ez tehát a normális állatok Peyer-féle mirigyeiből készült extraktum (N-extraktum) Egyidejűleg az N-extraktum egy részét neuraminidázzal kezeljük. A liofilizált N-felülúszót kétszer desztillált vízben oldjuk, a pH-t 5,5-re állítjuk, és egy órán át 37 °C-on 250 egység neuraminidáz adaggal (Behring—Werke, Marburg) inkubáljuk. Utána a fölösleges neuraminidázt 95 °C-on 30 percig tartó melegítéssel inaktiváljuk, centrifugáljuk, és a felülúszót újból liofilizáljuk. A liofilizátum a normális (azaz nem részben májuktól megfosztott) állatok Peyer-féle mirigyeinek neuraminidázzal kezelt extraktuma, az NND-extraktum. Azt tapasztaltuk, hogy mindegyik extraktum, tehát a májuktól részben megfosztott állatok Peyer-féle mirigyeiből nyert TH-extraktum utólagos neuraminidázkezelés nélkül, a normális állatok Peyer-féle mirigyeiből nyert N-extraktum utólagos neuraminidáz-kezelés nélkül, valamint a normális állatok Peyer-féle mirigyeiből nyert NND-extraktum is utólagos neuraminid&z-kezeléssel a májsejtek szaporodásának fokozódását idézi elő. Az illető extraktumok 1 g-ját 0,9%-os nátrium-klorid oldatban oldottuk, és az oldat 2,0 ml-éí injektáltuk intraperitonealisan (i. p.) normál patkányokba. Ugyanilyen mennyiségű 0,9%-os nátrium-klorid oldatot injektáltunk intraperitonealisan kontroli-állatokba is. A májsejtek szaporodásának mérése a TH-extraktum injekciója után a DNS-szintézis mérésével történt. A mérés úgy történik, hogy specifikusan a DNS- be beépült radioaktív anyagok mennyiségét mérjük. Ilyen anyagként 3H-metil-timidint használtunk. Ennek fajlagos aktivitása 25 Ci/mmól volt. (Gyártó: Radiochem. Center, Amersham). Mind a kísérleti állatokba mind a kontrolállatokba a Th-, N-, illetve NND-extraktumok injekciója után 19 órával 50-50 |iCi 3H-metil-timidint injektálunk. Az állatokat 1 óra múlva leöljük. A májat eltávolítjuk, és —20 C-on tároljuk. Ezután történik a máj DNS-ének extrakciója Weinbren és Woodward [Br. J. Exp. Path. 45, 442— 449 (1964)] szerint. Ennek az extraktumnak egy részét használjuk radioaktivitás-méréshez. Ezért a PCA (Perklórecetsav)-tartalmú oldat 1,5 ml-ét 0,5 ml 1 n nátriv m-hidroxid oldattal semlegesítettük. A keletkező olcatot egy szeintillációs üvegcsében 5 ml Triton X 100-zal és 10 ml toluollal (0,6 PPO; PPO — 1,5-difenil-oxazol) homogenizáljuk. Utána folyadék-scintillációs számláló (Intertechnique, Paris) segítségével mérjük a radioaktivitást beütésszám/perc-ként. A DNS-extraktum egy további részét a DNS-koncentráció Burton szerinti meghatározására [Biochem. J. 62, 315—323 (1956)] használjuk. Ezen a módon tehát a fajlagos aktivitást kapjuk beütésszám/perc/mikrogramm DNS-ként. így a következő táblázatban megadott értékeket kapjuk: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
