185603. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rosszindulatú daganatos sejtek kimutatására
1 185 603 2 MgSO„•7H20 152,8 mg/liter NaCl 7400 mg/liter NaHCOs 1200,0 mg/liter Na2 HP04 vízmentes Na2HP04-7H20 290,0 mg/liter 5 ZnS04 • 7H20 0,0288 mg/liter Más komponensek Glükóz 1100 mg/liter 10 hipoxantin 4,0 mg/liter linoleinsav liponsav 0,2 mg/liter fenol vörös 1,2 mg/liter putreszcin 2HC1 nátrium pipurát 110,0 mg/liter 15 timidin 0,7 mg/liter Aminosavak alanin 9,0 mg/liter 20 L-arginin HC1 211,0 mg/liter L-aszparagin • H20 15,101 mg/liter L-aszparaginsav 10,1 mg/liter 25 L-cisztin 25,0 mg/liter L-cisztin HC1 ■ H20 L-glutaminsav 14,7 mg/liter L-glutamin 146,0 mg/liter Glicin 7,51 mg/liter 30 L-hisztidin HC1 ■ H20 23,0 mg/liter L-izoleucin 2,6 mg/liter C-leucin 13,0 mg/liter L-lizin HC1 29,0 mg/liter l^metionin 4,48 mg/liter 35 L-Fenílalanin 5,0 mg/liter L-prolin 11,5 mg/liter L-szerin' 10,5 mg/liter I^treonin 3,57 mg/liter L-triptofan 0,6 mg/liter 40 L-tírozín 1,81 mg/liter L-tirozin (nátrium szulfát) L-valin 3,5 mg/liter 5. példa Tisztított malignin előállítása nyers malignintartalmű frakcióból: A maglignin terméket a 2. példában az astrocytinra leírt módszerrel szabadítjuk meg a szennyeződésektől. A vékonyrétegkromatográfiás lépésben a malignin terméket 0,91 ±0,02 távolságra észleljük különálló folt formájában a standard citokróm C-hez viszonyítva, amelyet viszonyítási alapul használunk. A malignin molekulasúlya hozzávetőleg 10 000. Az igy kapott termék vízben és semleges, valamint savas pH-nál oldódik, alkalikus pH-nál azonban oldhatatlan. Spektrofotometriás abszorpciós csúcsot 280 mp-nál mutat. A termék 10 000 molekulasúlyú polipeptid. A II. táblázat a tenyészetek egymást követő generációiban stabilizált, fermentációs tenyésztéssel előállított malignin molekulasúlyát mutatja, a molekulasúlyt vékonyrétegkromatográfia segítségével határoztuk meg. A módszer alapvetően korlátozott volta miatt figyelemre méltó a molekulasúly meghatározás reprodukálhatósága. II. táblázat A termelt malignin molekulasúlyának reprodukálhatósága Kísérlet száma Molekulasúly Kísérlet száma Molekulasúly Kísérlet száma Molekulasúly 1 9 500 9 10 100 17 10 180 2 8 900 10 10 180 18 10 190 £ 10 000 11 10180 19 10 190 4 10 050 12 10 180 20 10 180 c 10 100 13 10 180 21 10 000 6 10 000 14 10 050 22 9 500 7 10 150 15 10180 23 10 180 8 12 500 16 10 190 A malignin kovalensen kötött aminosavait 6 n sósavas hidrolízissel mutatjuk ki, majd mennyiségileg meghatározva az alábbi aminosav összetételt kapjuk: 4. példa 45 Nyers malignin-prekurzort tartalmazó frakció előállítása: A 3. példában előállított mosott sejteket szuszpendál- 50 juk, majd mechanikailag szétroncsoljuk olyan feltételek mellett, amelyeknél a legtöbb protein nem denaturálódik. A mosott sejteket előnyösen 4 °C-on 20 másodpercig ultrahanggal kezeljük. Ezután a sejtmaradékokat 30 000 percenkénti fordulatszám mellett centrifugáljuk 55 30 percig és a felülúszót dekantáljuk. 10 ml-es 7,2-es pH-jú pufferoldat aliquotokkal mossuk a visszamaradt sejtmaradékokat. Ezt is ultrahang kezelésnek és centrifugálásnak vetjük alá, majd a felülúszókat összeöntjük. Az eljárást még egyszer megismételjük. Az összeöntött felülúszókat bepároljuk és így a 30 ml térfogatot 6-7 ml-re csökkentjük. Egy aliquotot teljes fehérje analízisnek vetünk alá és a maradékot az 1. példában az astrocytin-prekurzomál leírt módon frakcionáljuk. 55 Maradékok hozzávetőleges száma aszparaginsav 9 treonin 5 szerin 5 glutaminsav 13 pirolin 4 glicin 6 alanin 9 valin 6 1/2 cisztin 1 metionin 2 izoleucin 4 leucin 8 tirozin 3 fenilalanin 3 lizin 6 hisztidin 2 argínin 5 Összesen kb.: 89 9
