185603. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rosszindulatú daganatos sejtek kimutatására
1 185 603 2 Más fehére meghatározási módszert is alkalmazhatunk, például Folin—Lowry-féle meghatározási módszer is szóba jöhet, de standardokat mindenképpen kell használni, hogy a kontroli-tartományt és az S-TAG mínusz F-TAG koncentráció tumornak megfelelő értékhatárait 5 meghatározzuk. Äz eredményeket a szérum ml-ére eső TAG mikrogrammokban adjuk meg, ez megfelel az S-TAG mínusz F-TAG koncentráció értékeknek. A TAG értékek a nem agytumoros betegek esetében 0-tól (vagy negatív 10 számtól) 135 mikrogrammig terjedhetnek szérum ml-enként. Minden 100 pg/ml-nél nagyobb eredménynél megismételjük a meghatározást. Néhány más tumor magas TAG értékeket eredményezhet, különösen ha másodlagos (áttételes) daganatok vannak az agyban. Az agy- 10 daganatos betegeknél a TAG érték általában 136-500 vagy több mikrogramm/szérum ml. Az első „vak” kísérletben 50 vérmintában a példa szerinti módon astrocytinből és brómacetil-cellulózból előállított „cél”reagenst alkalmazva 11-et azonosítottunk agytumornak 20 11 agytumorból és 28-at normálisnak 32 normálisból. A négy feltételezett normálisból (azaz nem agytumor kontroll) egyről kiderült, hogy pajzsmirigy daganat, melyet már láthatóan néhány évvel korábban sikeresen kezeltek. A további három normális páciens 60-70 év 25 körüli rossz egészségi állapotban lévő beteg volt, akik valószínűleg nem diagnosztizált rákban szenvedtek. A további 7 mintából három esetből három ízben helyesen azonosítottuk a Hodgkin-féle betegséget, a tumortartományhoz tartozó egy minta (136-500 /agTAG/ml) 20 súlyos gliozisban szenvedő betegnek felelt meg és három minta a nem tumor-tartományban (0-135 pg/TAGÍml) koponya közötti tömeg (bizonytalan, de nem tumor) diagnózisnak, oszteoszarkómának (nem agytumor) és melanotikus szarkomának (nem agytumor) felelt meg. 25 A fenti módszerrel maligninból és rosszindulatú agydaganatokból és „normális” daganatokból előállított célvegyületeket használtunk további vizsgálatra. További kísérleteket végeztünk a példa szerint, az 50—114-ig terjedő összes humán szérum-mintára. A ter- ^0 mékek és módszerek felhasználhatóságát a fenti teszteredményekkel együtt az V. táblázat mutatja. 9. példa 45 Ráksejtek kimutatása TAG-ból kapott radioizotóp jelekkel: Ebben a példában a TAG radioaktív jelzett anyaghoz kapcsolhatóságát mutatjuk be. A radioaktív jelzett TAG 50 beoltása állatoknak biztonságosnak és hatásosnak mutatkozott. A radioaktív jelzett TAG előnyösen a ráksejtekben lokalizálódott a normális szövettel összevetve, így bebizonyosodott, hogy a már kimutatott in vitro hatás anti-malignin-TAG termékekre vonatkozóan in vivo is 55 érvényesül. TAG jelzése 99 m Technéciummal ("mTcj Jelzési folyamat 60 1 2 1. Két TAG készítményt használtunk (TAG-1 ésTAG-2). Az egyaránt 0,4 mg/0,5 ml koncentrációjú mintákat két külön steril légtelenített ampullába helyezzük. 2. Mindkét ampullába 0,1 ml ónklorid-oldatot adunk 65 (10 mg SnCl2- H20 100 ml 0,01 n sósavban). Az ampullákat 3-4 percig keverjük. 3. 0,1 ml (6mCi) "mTc-pertechnetátot (nátrium só) adunk hozzá és 2-3 percig keverjük. A jelzési hatékonyság kimutatása 99 ^ Te-TAG-1 és 99mTc-TAG-2 mintákat vizsgáltunk a jelzési folyamat hatékonyságának kimutatására leszálló papír kromatográfia segítségével, Whatman-papírral és oldószerként 85 %-os metanollal. Hasonló kísérletet végezr tünk nátriurn-pertechnetát-"mTc-vel, amely kontrollként szolgált. 2 óra múlva a papírokat eltávolítottuk a kromatográ-, fiás tartályból és két részre osztottuk: 1. 1 cm-re a felcseppentés helyétől, 2. a maradék papír egészen az oldószer frontig. Mindkét részben gamma-hullám scintillációs számolót alkalmazva kimutattuk a radioaktivitástartalmat cpm-ben. Mmden papírcsíkon körülbelül 50 lambda volt. Antigén-antitest reakció kimutatására szolgáló eljárás A jelzett oldat egy részét Ouchterlony-gél lemezre juttattuk, hogy meghatározzuk, hogy reagál-e az antigénantitest reakcióban maligninnel. 3 óra múlva a kapott éles reakciósávokat a gélről eltávolítottuk és a radioaktivitás-tartalmat megmértük. A reakcióban nem részt vevő egyenlő mennyiségű gélt is eltávolítottuk és referenciaként ennek is megmértük a radioaktivitás-tartalmát. Eredmények Jelzési hatékonyság 1. táblázat 99mTc-TAG-l és99mTc-TAG-2 jelzési hatékonysága Vegyület ^kali' Beütés/ zacio a , , perc papíron r % Vegyülettípus NaTc04--99mTc Kiindulási 4,94X105 terület 7,33 redukált Tc04 NaTc04--99mTc Oldószer- 6,25X104 front 92,67 Tc04~ "mTc-TAG-l Kiindulási 4,35X10® terület 98,47 TAG-99mTc ""’Tc-TAG-l Oldószer- 6,76X104 front 1,53 Tc04 "mTc-TAG-2 Kiindulási 1,96X10* terület 98,01 TAG-99mTc "mTc-TAG-2 Oldószer- 3,98X10* front 1,99 Tc04" 2. táblázat Antigén-antitest reakció Gél-terület Beütés/perc % T AG-2 vonal 1,99X10® 92,04 Háttér-gél 1/72X105 7,96 15
